RP-HPLC法测定苦参中苦参碱的含量

摘要：目的建立测定苦参中苦参碱含量的RP-HPLC法。方法采用反相高效液相色谱法，Kromasil C18柱(250 mm × 4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水-三乙胺(V：V：V =105.00：95.O0：0.04)。检测波长为225nm，柱温为室温。结果苦参碱质量浓度在3.92～78.4mg/L内与峰面积呈良好线性关系，r=0.9998(n=6)；平均回收率为97.2％，RSD为2.1％(n=9)。结论：测定方法准确、可靠，为苦参药材质量评价提供了可靠依据。
关键词：苦参；苦参碱；反相高效液相色谱法
苦参始载于<神农本草经>，列为中品。味苦性寒，归心、肝、胃、大肠、膀胱经，为我国传统用药。具有清热利尿、燥湿杀虫的功能。主治热痢便血、赤白带下、湿疹疮疡。现代药理研究表明，其中主要有效成分苦参碱具有杀虫抗菌、保肝、抗肿瘤、抗心律失常等多种药理作用。目前其含量测定的文献报道主要有薄层扫描法、HPLC法和毛细管电泳法等。其中薄层扫描法是一种离线技术，其各步操作基本上是在开放体系中进行，因此，影响定量结果的因素较复杂，准确性差；HPLC法分离分析奎诺里西啶类生物碱，以氨基为键合相获得了较为满意的分离效果，但样品须经固相萃取净化，实验操作繁琐。为了有效的控制中药材及其制剂的质量，建立RP-HPLC法。该方法系统适应性强，样品无需萃取，实验操作简便，并在此基础上对不同产地苦参中苦参碱的含量进行了分析测定。
l 仪器与试药
日本岛津LC-10AD液相色谱仪：日本岛津SPD-10A紫外检测器、日本岛津CKChromTM色谱工作站。苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：805-200005)。甲醇为色谱纯，三乙胺为分析纯，水为二次重蒸水。苦参药材由沈阳药科大学孙启时教授鉴定为豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait．)的干燥根。
2 方法与结果
2．1 对照品溶液的制备
取苦参碱对照品约9.8 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，配成含苦参碱0.392g/L 的对照品溶液。
2．2 供试品溶液的制备
取苦参粉末1.0 g(湖南长沙和安徽苦参取样0.5 g)，精密称定，置100mL磨口三角瓶中，加入氯仿50mL、浓氨水1.0mL，密塞，超声提取20min。提取液用滤纸过滤，药渣和滤纸用20mL氯仿洗涤3次，合并滤液，于75℃水浴中回收溶剂，残渣用水定容至25mL量瓶中，摇匀。经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。
2．3 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18(250mm × 4.6 mm，5μm，天津开发区色谱分析仪器有限公司)；流动相：甲醇-水-三乙胺(V：V：V=105.00：95.00：0.04)；流速：0.8 mL/min；检测波长：225nm：柱温：室温；进样量：20μL。
2．4 标准曲线的绘制
精密量取苦参碱对照品溶液0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mL置10mL量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。取上述溶液20μL进样，在上述色谱条件下进行RP-HPLC分析，以对照品质量浓度(mg/L)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，苦参碱质量浓度在3.92～78.4mg/L内与峰面积线性关系良好，回归方程为A=6187.7p一5 351.8，r=0.9998(n=6)。
2．5 精密度试验
2．5．1 仪器精密度
吸取同一对照品溶液20μL，在上述色谱条件下重复进样6次，计算RSD为1.8％。
2．5．2 方法重复性
取同一苦参样品(No．16)6份，每份1.0g，精密称定。按“2．2”条操作，在上述色谱条件下进行RP-HPLC分析，计算RSD为2.1％。
2．6 回收率试验
取已知含量的苦参样品9份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入一定量的对照品溶液，按“2．2”条操作，在上述色谱条件下进行RP—HPLC分析。
2．7 样品溶液稳定性试验
取苦参样品，按“2．2”条操作，分别在1、2、4、8、16、24h测定。结果表明，苦参碱24h内稳定性良好，RSD为2.8％。
2．8 样品测定
取苦参样品，按“2．2”条操作，在上述色谱条件下进样分析，计算苦参碱含量。
3 讨论
a．22个不同产地的苦参药材中，苦参碱含量差别较大，同一省份不同地区之间也存在着较大差别。其中，安徽、湖南长沙娄底市苦参中苦参碱含量最高，其他大部分产区苦参中苦参碱含量较低。
b．建立色谱方法时，比较了Kromasil-NH2柱和Kromasil C18柱的分离效果。结果表明：以Kromasil-NH2柱为固定相，样品不经中性氧化铝小柱固相萃取，苦参碱出峰处杂质干扰严重，通过改变流动相的组成难以实现基线分离。
C．考察药材提取工艺时，采用超声提取法，考察了甲醇、70％( φ)乙醇、2％(φ)醋酸水溶液和氯仿的提取效率。结果表明：氯仿对苦参碱的提取效率最高。又考察了氯仿超声和浸渍提取方法。研究表明：超声和浸提效果相当。在此基础上，考察了足够量的氯仿超声提取2O、3O和40min的含量差异，结果表明：超声提取20min苦参碱已基本提取完全。
d．选择定容溶剂时，比较了以甲醇、流动相和水为定容溶剂的谱图。结果表明：以水为定容溶剂杂质干扰少、系统适应性强，样品无需氧化铝小柱净化，从而简化了样品处理过程。
参考文献：
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