摘要：尿中修饰核苷已被研究用作可能的
肿瘤标记物，目前最常用的分析方法为反相高效液相色谱法，其不足之处是分析周期太长。为此，建立了应用整体柱的高效液相色谱方法对尿中修饰核苷进行分析，所用缓冲液为25mmol／L磷酸二氢钾溶液(pH 4.55)和60％ (体积分数)的甲醇水溶液，线性梯度洗脱，检测波长为260nm。12种目标核苷可被完全分离。所建立的方法在分离度、线性、重现性、灵敏度及回收率等指标上与普通反相液相色谱法相近，但分析周期大大缩短，仅为23min，适合于大量
临床样品的分析。
关键词：高效液相色谱法；整体柱；核苷；尿
核糖核酸(RNA)在代谢过程中会产生游离的正常核苷和修饰核苷。正常核苷在尿中含量甚微，修饰核苷的含量相对来说比正常核苷高一些。但对成年人来说其排放浓度差异较小，分布在一个较窄的范围内。当人体的某部分发生癌变时，RNA周转加快，导致尿液中的修饰核苷的含量急剧增加。因此，可以通过监测尿中修饰核苷的含量对
癌症的发病进行早期诊断 。
分析尿中修饰核苷的方法有很多，如免疫分析法、毛细管电泳法和高效液相色谱法。反相高效液相色谱法是目前最常用的方法，对感兴趣的核苷可以达到较好的分离，不足之处是分析周期太长，影响大量样品的分析。近几年来，整体柱因具有制备简单、易于改性、柱压低及传质速度快等优点而备受关注。本实验的目的就是建立一个应用整体柱的高效液相色谱方法对尿液中的核苷进行分析检测，以使其更适合于临床应用。
1 实验部分
1．1 仪器和试剂
液相色谱系统配有LC-lOAtvp泵、SPD-lOAvp检测器、SIL-10Advp型自动进样器、SCL-1OAvp系统控制器和Shimadzu．Class-VP色谱工作站(日本岛津公司)。整体柱为Chromolith Performance RP-18e(100mm×4.6mm i．d．，MERCK公司)。
12种核苷标准品和内标8-溴化鸟苷(8-bromoguanosine hydrate，Br8G)(Sigma公司，USA)；甲醇(色谱纯试剂，Tedia公司)；苯基硼酸亲和凝胶(Affi-Gel 601)(Bio-Rad公司)；磷酸二氢钾为国产分析纯试剂。所有溶液均用Milli-Q超纯水配制。
1．2 实验方法
1．2．1 标准溶液的配制
分别称取适量的12种核苷标准品，配制浓度为4.0mmol／L的假尿嘧啶核苷(pseudouridine，Pseu)、尿嘧啶核苷(uridine，U)和腺嘌呤核苷(adenosine，A)溶液，2.0mmol／L的胞嘧啶核苷(cytidine，C)、1-甲基腺苷(1-methyladenosine，mlA)溶液，1.0mmol／L的2-甲基鸟苷(2-methylguanosine，m2G)和2，2-二甲基鸟苷(2，2-dimeth—ylguanosine，m22G)溶液，0.8 mmol／L的1-甲基鸟苷(1-methylguanosine，mlG)和黄嘌呤核苷(xantiosine，X)溶液，0.2mmol／L 的鸟嘌呤核苷(guanosine，G)溶液，1.3mmol／L 的N4-乙酰胞苷(N4-acetylcytidine，ac4C)溶液，0.4mmol／L的6甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)溶液为储备液。根据实验需要将上述储备液稀释至所需浓度。
1．2．2 尿中核苷的提取
采用苯基硼酸亲和凝胶提取尿中核苷。
1．2．3 色谱分离条件
用25mmoVL磷酸二氢钾溶液(pH 4.55)和60％(体积分数)的甲醇水溶液做二元梯度淋洗，检测波长为260nm。整体柱反相高效液相色谱的线性梯度淋洗程序。
2 结果与讨论
2．1 实验条件的选择
把通常的反相液相色谱方法移植于整体柱反相液相色谱法，得到的分离效果并不好，其中ac4C和m2G两峰重合。对实验条件进行了优化，适当提高甲醇．水的梯度变化使ac4C和m2G两个重要的峰得到了较好的分离。整体柱具有柱压低及传质速度快的优点，所以可用于高流速的分离，且提高流动相流速对柱效的影响很小。实验考察了流动相流速对分离的影响。当流动相流速增加到2mL／min时，除出峰最早的Pseu和C的分离效果变差外，其他峰仍然可以得到很好的分离。实验最终选择流动相流速为1.2mL／min。标样和尿样的色谱图。
2．2 分析特性
2．2．1 线性和灵敏度
将储备液按一定比例混合，并分别稀释2.5，5，10和20倍，对上述溶液进行分析。在人尿液的核苷排放范围内，所有测定的核苷的线性相关系数都大于0.99，且灵敏度满足分析要求。
2．2．2 重现性和回收率
在选定的实验条件下连续进标样5次，各组分保留时间的平均相对标准偏差(RSD)为0.25％～2.20％，峰面积的平均RSD为0.81％～1.89％，重现性较好。取一定体积的尿液分别加入相同体积的水和4个不同浓度的标样，计算回收率。回收率范围在70％～120％。其中U回收率为118.9％，可能是由于尿中杂质干扰所致。
2．3 样品测定
用本方法分析了5名癌症患者和5名正常成年人的尿样，并对尿样中的核苷浓度进行了比较。正常情况下，应收集受检者24h的全部尿样，但这样做很不方便。有研究¨ 表明，核苷浓度与肌酐浓度的比值在24h尿样和随机尿样中相同，故用随机尿样测定计算得到的核苷含量与肌酐的含量比来衡量，所得结果可见，癌症患者尿中所含核苷值明显高于正常人。更多的应用研究有待进一步进行。
3 结论
实验结果表明，用整体柱分离尿中核苷可达到良好的分离度，其线性、重现性、灵敏度及回收率等指标都与通常的反相液相色谱法 相近，且分析时间缩短，只需23min，比通常的反相液相色谱法减少约30min，大大地提高了分析效率，更适合于在实际临床中应用。
参考文献：
[1] Xu G，Di Stefano C，Liebich H M，Zhang Y，Lu P．J Chromatogr B，1999，732：307
[2] Liebieh H M，Xu G，Di Stefano C，Lehmann R．J Chromatogr A，1998，793：341
作者：
2007-5-18