肿节风药材中反丁烯二酸和异秦皮啶的含量测定

摘要：目的建立肿节风药材中反丁烯二酸和异秦皮啶的含量测定方法。方法采用RP-HPLC外标法，Agilent Zorhax Eclipse XDB-Cl8色谱柱(4.6mm×l50 mm，5μm)，以2％乙腈和0．1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，检测波长210nm。结果反丁烯二酸在11.66～1.17×lO00,μg范围内线性关系良好，平均回收率为l01.5％ ，RSD=2.5％；异秦皮啶在40.10～962.40μg范围内线性关系良好，异秦皮啶平均回收率为98.9％ ，RSD=3.3％。结论所用方法简便、准确，重复性好，在同一色谱条件下可同时测定反丁烯二酸和异秦皮啶的含量。
关键词：肿节风；反丁烯二酸；异秦皮啶；高效液相色谱法
肿节风为常用草药，也是许多药典及部颁成方制剂的处方药物。《中国药典>>2000年版收载的肿节风为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb．)Nakai的干燥全株。肿节风具有显著的抗菌、消炎、止痛及一定的肿瘤抑制作用，其主要化学成分为有机酸、倍半萜、黄酮及香豆素类等。反丁烯二酸具有抗菌消炎的药理活性，而异秦皮啶在体外活性实验中显示出一定的肿瘤细胞抑制作用。为有效地控制药材质量，特建立高效液相色谱法，同时测定药材中异秦皮啶和反丁烯二酸的含量。
1 实验部分
1．1 仪器与试药
高效液相色谱仪包括Waters 2695—996，Empower工作站(美国Waters公司)；Mettler AE240电子天平(梅特勒公司)；水浴锅(上海实验仪器厂)；超声波震荡器(天津奥特恩斯仪器公司)；Milli—Q超纯水仪(Millypore)。反丁烯二酸、异秦皮啶对照品(中国药品生物制品检定所)；乙腈和磷酸为色谱纯；水为超纯水；对照药材(中国药品生物制品检定所)。
1．2 色谱条件 
Zorbax Eclipse XDB—Cl8色谱柱(4.6mmx150mm)，流动相A为2％乙腈和0.1％磷酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱。检测波长210nm，柱温35℃。
1．3 对照品溶液和样品溶液的制备
精密称取两份反丁烯二酸对照品及异秦皮啶对照品适量，分别用甲醇制成反丁烯二酸0.236g/L和异秦皮啶0.064 g/L 的混合溶液(含量测定用)及反丁烯二酸0.320g/L和异秦皮啶0.036g/L的混合溶液(加样回收用)作为对照品溶液。
精密称取药材0.5 g，置索氏提取器中，加入约100 ml乙醇至锥形瓶中，索氏提取，提取液置蒸发皿，蒸干，用流动相A转移至l0ml量瓶中，摇匀并稀释至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤，即得样品溶液。
1．4 方法与结果
1．4．1 线性关系的考察分别精密称取反丁烯二酸、异秦皮啶对照品适量，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成对照品溶液(含反丁烯二酸l1.66μg/ml、异秦皮啶80.2μg/ml)。精密吸取不同体积的反丁烯二酸对照品溶液1.0、10.0、20.0、50.0、100.0μl 和异秦皮啶对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0μl，注入液相色谱仪测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，分别得回归方程为：Y反丁烯二酸=1.382 X10000X+1.484X lO000(r=0.9999)；Y异秦皮啶：1.396 XlO000X +1.439×lO0000(r=0.9999)。结果表明：反丁烯二酸在l1.66～1.17 X lO00μg、异秦皮啶在40.10～962.40μg范围内线性关系良好。
1．4．2 稳定性实验取肿节风药材样品溶液在0、2、4、8 h分别进样分析，记录峰面积比值，结果反丁烯二酸和异秦皮啶的RSD分别为2.20％和1.75％。
1．4．3 精密度实验取肿节风药材样品溶液重复进样5次，记录峰面积比值，结果反丁烯二酸和异秦皮啶的RSD分别为0.29％和2.09％。
1．4．4 重复性实验取同一批广西药材样品6份，索氏提取4 h，按“1．3”项下索氏提取方法制备样品溶液，在“1．2”项条件下分析，结果反丁烯二酸含量为0.202％，RSD =3.43％；异秦皮啶含量为0.026％，RSD=3.72％(n=6)，表明方法的重复性较好．
1．4．5 回收率实验采用加样回收法，取已知含量的样品加入一定量对照品，按“1．3”项下方法制备样品溶液，在“1．2”项条件下，进样，测得反丁烯二酸的平均回收率为101.46％ ，RSD=2.50％；异秦皮啶的为98.93％，RSD=3.30％。结果见表2。
1．4．6 样品的测定取20批药材，按“1．3”项下方法提取并制备样品溶液，进样测定。
2 讨论
2．1 实验方法的选择
2．1．1 不同提取方法的比较采用以下几种提取方法：A法超声提取lh，精密称取0.5g药材，加入50 ml 70％乙醇，超声提取lh；B法超声提取2 h，精取0.5 g药材，加入50 ml 70％乙醇，超声提取2 h；C法回流提取l h，精密称取0.5 g药材，加入50 ml70％乙醇，回流提取l h；D法回流提取2 h，精密称取0.5 g药材，加入50 ml 70％乙醇，回流提取2 h；E法回流提取3 h，精密称取0.5 g药材，加入50 ml70％乙醇，回流提取3h；F法95％乙醇索氏提取，精密称取0.5 g药材，用50ml 95％乙醇索氏提取4 h；G法70％乙醇索氏提取，精密称取0.5 g药材，用50ml 70％乙醇索氏提取4 h。结果G法稳定，故选择70％乙醇进行索氏提取。
2．1．2 色谱条件的选择我们曾选用不同厂家或不同型号的色谱柱(Angilent Zorbax Eclipse XDB-C18，Agilent Zorbax SB-Cl8，Allteeh Allti-macC18等)
进行试验，结果表明：Angilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱对肿节风药材的分离效果最好。也曾选用乙腈-水，甲醇-水，乙腈-0.1％磷酸等溶剂系统。结果表明乙腈-0.1％磷酸对肿节风药材的分离效果最好。
根据反丁烯二酸和异秦皮啶的紫外吸收光谱特征，选择210nm作为检测波长。
2．2 色谱峰的认定
采用DAD检测器，考察供试品液相色谱图中峰a和峰b的紫外吸收，结果显示：峰a的紫外吸收与反丁烯二酸对照品的紫外吸收一致；峰b的紫外吸收与异秦皮啶对照品的紫外吸收一致。
《中国药典》2000年版肿节风项下收载了异秦皮啶的[含量测定]项。按该方法测定异秦皮啶的含量明显高于文中方法的测定结果。可能在原色谱条件下，异秦皮啶的出峰时间太快，与附近的其他色谱峰重合，测定的异秦皮啶峰面积明显高于其真实值，因而含量过高；而文中方法在梯度洗脱中，可完全将异秦皮啶的色谱峰与其他杂质峰分开，故原色谱条件测出的异秦皮啶含量高于我们的测定结果。
从样品测定结果可以看出：不同产地的肿节风药材中，反丁烯二酸和异秦皮啶的含量差异均大。可能因产地和药材人药部位的不同所致。在所测药材中，广西药材的反丁烯二酸和异秦皮啶的含量均较高，接近对照药材的含量水平。因此，在制剂生产过程中，使用规范药材对制剂的质量控制相当重要。文中所建立的RP-HPLC法，可同时测定肿节风药材中异秦皮啶和反丁烯二酸的含量，能够有效地控制药材质量。
参考文献：
[1] 中华人民共和国国家药典委员会．中国药典[S]．一部．北京：化学工业出版社，2000．179，附录191