摘要：目的：建立降脂颗粒质量标准。方法：TLC定性，HPLC-ELSD法测定含量。流动相：乙腈-水(30：70)；漂移管温度：105℃；流速；2.70mL／min。结果：黄芪甲苷线性范围在1.0～5.0μg之间；平均回收率99.19％；RSD=2.20％。结论：此方法快速、灵敏、准确，重复性好。为建立降脂颗粒质控标准提供了科学依据。
关键词：降脂颗粒；黄芪甲苷；薄层色谱；高效液相色谱法
降脂颗粒是由黄芪等十味
中药组成，具有健脾利湿，祛瘀化浊的功能，适用于
高血脂症的患者，为保证药物的安全性，有效性和可控性，我们对
制剂质量进行研究，建立了6味药材(黄芪、绞股兰、决明子、虎杖、丹参和山楂)的薄层鉴别；对君药黄芪中有效成分黄芪甲苷，采用以蒸发光散射为检测器的高效液相色谱法(HPLC-ELSD)进行含量测定。从而圆满完成了本制剂的质量研究。
ELSD是一种新型质量型检测器，其响应值取决于待测物质的质粒数量和大小，与化合物的光学特性无关，因此适用于不具有发色团，不挥发性的成分，如甾萜、皂苷、内酯类等的测定。本文根据黄芪甲苷的结构特点和化学性质，建立了反相高效液相。蒸发光散射法 。实验证明该法具有快速、灵敏、准确、分辩率高的优点，优于药典规定的薄层扫描法。
1 仪器与试药
HP1100高效液相色谱仪(美国惠普)；黄芪甲苷、熊果酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚对照品，决明子、虎杖、丹参对照药材(由中国药品生物制品检定所提供)。3批降脂颗粒及阴性样品(由中国中医研究院中药研究所剂型室提供)；试剂均为色谱纯及分析纯。
2 定性鉴别
2．1 黄芪 2 取[含量测定]项下的供试品溶液，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液5μL，对照品溶液3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13：7：2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的棕褐色斑点。
2．2 绞股兰 取本品10g，研细，加甲醇30mL，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加10％氢氧化钠溶液5mL使溶解，再加水25mL转移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加水1～2mL使溶解，放冷，通过DIO1型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水100mL洗脱，弃去水液，再以70％乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取绞股蓝对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)
10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的棕褐色斑点。
2．3 决明子、虎杖 取本品15g，研细，加甲醇50mL，浸渍1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水lOmL使溶解，再加盐酸1mL，置水浴中加热30min，立即冷却，用乙醚提取2次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿1mL使溶解，作为供试品溶液。另取决明子、虎杖对照药材各1g，分别同法制成对照药材溶液。再取大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，加甲醇制成每1mL各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液1OμL、对照药材溶液各5μL、对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(3O～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙色荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。
2．4 丹参 取本品7g，研细，加水50mL，浸泡过夜，加热回流提取30min，静置过滤，滤液用10％盐酸酸化至pH2，用醋酸乙酯提取3次，每次10mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述二种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-丙酮-甲酸(25：10：4)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，再喷以5％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2．5 山楂 取本品7g，研细，加醋酸乙酯25mL，超声处理15min，滤过，滤液蒸至2mL，作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20：5：8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于110℃加热5～7min，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的紫红色斑点。
3 含量测定
3．1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX RX-C18(4.6mm×150mm)，5μm；流动相：乙腈-水(30：70)；流速：1.0mL／min，柱温：35℃，ELSD参数：漂移管温度：105℃，氮气流速：2.70mL／min。
3．2 标准曲线的制备 取干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.507mg的溶液，制成对照品溶液。分别精密吸取上述溶液2、4、6、8、10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量的自然对数为横坐标，对照品峰面积的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明，黄芪甲苷在1.014—5.07μg范围内线性良好。其回归方程为Y=4.155+1.745X，r=0.9997。
3．3 空白试验按处方中药味比例，自配不含黄芪的群药，按其工艺制成空白制剂，再按供试品溶液制备方法制备并测定，结果空白溶液在与黄芪甲苷对照品相同保留时间处未见明显色谱峰，故认为无干扰。
3．4 精密度试验精密吸取同一供试品溶液，在所确定的HPLC-ELSD条件下，进样lOμL，重复进样5次，求得黄芪甲苷峰面积自然对数的相对标准偏差<0.50％，表明仪器的精密度良好。
3．5 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液(批号030901)1OμL，分别于配制后在室温放置0、1、2、4、24、28h依次进行测定，结果RSD为0.83％，表明供试品溶液在24h内稳定。
3．6 重复性试验 取同一批号(030901)样品5份，按供试品溶液制备方法和测定法进行操作并测定黄芪甲苷的含量，经计算平均含量为每袋1.34mg，RSD为2.32％ 。
3．7 加样回收实验 取已知含量同一批号的样品适量，精密称定，分别精密加入黄芪甲苷对照品2％氢氧化钾甲醇溶液，按供试品溶液的制备方法制备，测定含量，计算回收率，结果平均回收率为99.19％，RSD为2.20％，n=5。
3．8 供试品、对照品溶液的制备及测定 对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品装量差异项下的内容物，研细，取7g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2％氢氧化钾甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，加热回流3h，放置至室温，密塞，再称定重量，用2％氢氧化钾甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25mL，蒸干，残渣加水25mL使溶解，并转移至分液漏斗中，用氯仿-正丁醇(2：1)提取4次，每次25mL，合并氯仿-正丁醇(2：1)液，用1％磷酸二氢钾水溶液50mL洗涤，弃去1％磷酸二氢钾水溶液，氯仿-正丁醇(2：1)液蒸干，残渣加水1～2mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水50mL洗脱，弃去水液，再以40％乙醇30mL洗脱，弃去40％乙醇洗脱液，继用70％乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至2mL量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液5、10、15μL与供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，将峰面积及浓度均取自然对数后，用回归方程法计算，求出供试品浓度的自然对数，再转换成供试品的含量。
4 讨论
参考文献确定了以2％氢氧化钾甲醇溶液作为提取溶剂。分别超声处理30min；加热回流提取2h；冷浸24h，处理，制成供试品溶液并测定，结果证明加热回流提取含量最高，故采用加热回流提取。加热回流时间分别考察了1／2、1、2、3、4h。结果证明2h黄芪甲苷已基本提尽，取3h为提取完全。供试品溶液用2％KOH甲醇溶液提取，黄芪中所含皂苷结构很相似，黄芪皂苷属于环黄芪醇苷。环黄芪醇类皂苷在一定强度的碱液中加热可转化为黄芪甲苷，故本品含量应为环黄芪醇类皂苷以黄芪苷计。
黄芪甲苷结构没有发色基团，只有很弱的末端吸收，为含量测定带来困难，直到目前为止均以双波长薄层扫描为含量测定依据。采用ELCD检测器，黄芪甲苷可以采用高效液相作为分离和分析手段，扩大了HPLC的应用范围，因此该法值得推广。在含量测定中对漂移观管的温度、氮气流量和流动相的比例等进行调试和实验，确定了最佳的色谱条件。
参考文献：
[1] 周春玲，鲁静．高效液相色谱．蒸发光散射检测测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J]．中国中药杂志，2000，25(3)：l66—168．
[2] 国家药典委员会编．中华人民共和国药典[S]．2000年版．一部．北京：化学工业出版社，2000．6．
作者：
2007-5-18