摘要：研究了用固相萃取-高效液相色谱法同时测定蜂蜜中l0种磺胺类药物残留量的方法。样品经三氯甲烷溶液提取，过Oasis HLB C18固相萃取柱净化，用乙腈洗脱l0种磺胺，反相高效液相色谱-紫外检测器测定。检测波长为270nm，柱温45℃．流动相：磷酸水溶液-乙腈梯度洗脱 该方法前处理简单，梯度洗脱分离效果和重现性好，在0.010～1.0mg／kg添加水平，l0种组分的回收率在86.5％～100.8％之间．室内相对标准偏差在3.5％～8.1％之间，线性范围为0.010～10μg／mL，检出限为0.005mg／kg 该方法快速、灵敏、专属，可用于食品中磺胺类药物残留量的常规检测.
关键词：磺胺类药物；固相萃取；高效液相色谱法；药物残留；蜂蜜；
磺胺类药物是以对氨基苯磺酰胺为基本化学结构的一类合成抗菌药物，由于取代基的不同，产生许多不同的磺胺药。这类药物广泛用作牲畜的抗菌药 在蜂产品中该药物的残留对人类健康有潜在的危害，可在
过敏性病人中引起过敏反应或者使病原体有机体产生抗药性。几种磺胺类药物同时测定的方法已有报道，但这些方法基本上均使用长时间的萃取和洗脱过程来获得满意的灵敏度。用高效液相色谱-荧光检测器对磺胺类药物残留测定，溶剂的极性、pH、溶氧量、溶剂的氢键、温度等都会影响荧光的发射强度或波长，且线性范围窄。虽然采用荧光检测器或柱后衍生化可获得一定专属性，但这些分析手段需要昂贵的仪器和额外的设备。不利于推广和实施国家标准。
我们采用固相萃取-高效液相色谱法建立快速、专属的蜂产品中磺胺类药物含量的测定方法。该系统不需要额外的柱后系统的仪器，所用的试剂适合于HPLC方法测定，紫外检测器受到的影响因素较小，线性范围宽，且灵敏度能够满足10种磺胺类药物含量的同时测定，较其它方法测定磺胺类药物种类多且专属性好的优点。
1 实验部分
1．1 试剂
乙腈和甲醇为色谱纯，水为Milli-Q SP TOC超纯水；三氯甲烷、磷酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠和无水乙醇等其他试剂均为分析纯。
10％的碱性氯化钠溶液：称取氯化钠10.0 g，加0．1 mol／L的氢氧化钠溶解并稀释至100 mL。
1.0 mol／L的磷酸二氢钠缓冲液：称取磷酸二氢钠120g，加水溶解并稀释到1000mL，用1.0mol／L的氢氧化钠溶液调节pH为6.0。
磺胺标准品：磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异嗯唑、磺胺二甲基异 唑、磺胺喹嗯啉标准品，纯度≥99.O％(Sigma公司提供)。标准溶液配制：准确称取10mg的每种磺胺标准品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得0.1 mg／mL的标准储备液。保存在4℃冰箱中，有效期为3个月。根据需要，临用时用流动相稀释成标准工作溶液。
1．2 仪器与设备
美国Agilent-1100型高效液相色谱仪，配有G1314A紫外检测器和HPCHEM色谱
管理系统，液相色谱柱：LiChrospher RP018e 250×4mm i．d．5μm，预柱Merck C18 10×4mm i．d．5μm。
瑞士BUSHI Rotavapor R-200型旋转蒸发器，配有LAuDA wKI|230型循环水式冷却系统。美国SUPELCOVisiprep DL SPE型固相萃取装置；固相萃取真空装置为SHZ—D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂生产)；Oasis，HLB型固相萃取小柱(3 cc(60 mg)C18 Warers)。
1．3 样品预处理
1．3．1 样品的提取称取1O.O0 g样品于5OmL的具塞离心瓶中，加入5mL 5％的乙醇一水溶液涡旋混匀，使蜂蜜完全溶于乙醇一水溶液中(蜂蜜如有析出结晶的现象，在低于60℃的水中加热，使其完全溶解，混合后再称样)，加入15mL三氯甲烷，旋涡混匀3min，离心3min，转移三氯甲烷于另一磨口离心管中，残渣用1OmL三氯甲烷提取1次，合并三氯甲烷。将三氯甲烷于40℃下浓缩至干，加入4mL10％的碱性氯化钠溶液混匀溶解残渣。加入5mL磷酸二氢钠缓冲液，于旋涡混合器上混匀2O s。
1．3．2 样品净化将带有阀的玻璃贮液器连接到Oasis HLB固相萃取柱上，上述混匀后的溶液倒入玻璃贮液器中，在减压条件下样液过活化好的固相萃取小柱。待样品溶液过柱完成后，加15-nL超纯水淋洗，抽真空5min，然后用5min乙腈洗脱于试管中。将乙腈洗脱液于40℃水浴中高纯氮气流浓缩至干，流动相溶解并定容至1 mL，0.45μm的微孔滤膜过滤供液相色谱分析。
1．4 液相色谱条件
流动相：A为0.O1 mol／L磷酸水溶液，B为乙腈： AB二元梯度洗脱程序：0～5 min(A与B体积比85：15)，5～10 min(A与B体积比75：25)，10～14 min(A与B体积比65：35)，最后回到初始条件；流速1.0 mL／min；柱温45℃；紫外检测波长270 nm。应用此色谱条件可获得良好的分离和适宜的保留时间，各组分均在15min内出峰。
2 结果与讨论
2．1 提取溶剂的选择
磺胺类药物一般为白色或微黄色结晶性粉末，难溶于水，较易溶于稀酸、稀碱和有机溶剂。分别选用乙腈、三氯甲烷和甲醇作为蜂蜜样品的提取溶液，在同一添加水平，相同实验条件下，对蜂蜜样品进行回收率实验，实验数据可以看出，使用三氯甲烷作提取剂，1O种磺胺类药物的回收率基本上在90％以上，乙腈和甲醇的回收率明显低于三氯甲烷作为提取溶剂的回收率。而且使用乙腈和甲醇，均出现样品基底干扰大，图潜的基线漂移现象。因此在本方法中选择三氯甲烷作为蜂蜜样品的提取溶液。
2．2 色谱柱的选择
实验发现，不同型号的色谱柱对磺胺类药物的分离效果有一定的影响。我们选择了以下5种不同型号与长度的色谱柱：LiChrospher 100 RP-18e 250X 4 mm i．d．，5μm；Kromasil KR 100-5 C18 250X 4.6 mmi．d．，5μm；Kromasil C18 150X 4.6 mmi．d．，5μm；Agilent ZORBAX Eclipse X DB-C 8 150X 4.6 min i．d．，5μm；ALLTIMA C18 150X 4.6 Mvm i．d．，5μm。实验结果表明，长色潜柱比短色谱柱的测定效果好，10种磺胺类药物有效分离且峰形好，不拖尾，基线相对平稳： 但若使用Kn，masil C18长柱作为分析柱，保留时间过长，磺胺喹嗯啉出峰需要1个多小时，灵敏度也有降低。因此，选择LiChrospher 100 RP-18e 250mmi的长色谱柱为分析柱，梯度洗脱，10种磺胺类药物在15min内完全分离，灵敏度也能满足分析的要求。
2．3 流动相选择
我们选择4种液相分离条件，确定了合适的分离条件。所有组分在15 min内出峰，满足快速分析要求。另外3种液相色谱条件均未能将10种磺胺类药物完全分离，尤其是磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲噻二唑，在这3种条件下，两色谱峰重合。
2．4 方法的线性关系
以乙腈为溶剂，配制磺胺类药物标准系列溶液浓度为0、0.10、0.20、0.50、0.75、1.00μg／mL于容量瓶中，进样量20μL外标法定量。其线性方程和相关系数。
2．5 方法的精密度和回收率实验
用不含有磺胺类药物的蜂蜜试样进行添加回收率和精密度实验，样品分别添加0.050 0、0.100、0.125、0.250、0.500μg／mL 5个浓度水平的磺胺药物标准溶液，摇匀，密封放置2 h，使标准溶液被样品充分吸收，然后按照样品前处理方法进行提取和净化，高效液相色谱测定(回收率实验各浓度均重复测定5次)。可以看出，在0.010～10μg／mL范围，5个添加水平回收率为82.4％～95.6％，相对标准偏差为3.5％～8.1％。回收率较高，相对标准偏差低，方法的重现性较好。
2．6 方法检出限和最低检测浓度
10种磺胺类药物样品添加浓度为0.01mg／kg，谱图的信噪比均大于10。因此，在本方法操作条件下10种磺胺类药物定量下限为0.005 mg／kg，当试样称样量为10.00 g，定容量为1mL时，检出限为0.5μg／kg。其检出限标准图谱。
2．7 方法的适用性
对不同蜜种的几批蜂蜜样品随机抽样得l0个样品，在100、250、500ng／mL 3个添加水平，分别进行10种磺胺类药物的添加回收率实验，所做样品空白实验证明，在10种磺胺类药物出峰区域里，未见干扰峰出现，说明方法的选择性很好。
3 结 论
固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的磺胺类药物，由于前处理使用固相萃取小柱，可以排除蜂蜜中大部分干扰物质的影响。使用紫外检测器，能够达到很高的灵敏度，保证了外标法定量的准确性和重现性。与其他方法相比，本方法具有快速、灵敏、专属的特点。
1.林海丹，谢守新，冯德雄，等．动物源性食品中磺胺类药物残留的固相萃取一高效液相色谱法测定【J】．分析测试学报，2003，22(1)：94—96．
作者：
2007-5-18