摘要： 通过微柱高效液相色谱法测定烟草样品中的植物色素；用90％丙酮震荡浸提烟草样品中的色素，提取液经Waters Sep-Park-C18固相萃取小柱预分离和富集，以Waters Xterra TM RP18(1.0×50mm，Φ2.5μm)色谱柱为固定相，(1+1)甲醇异丙醇溶液一水梯度为流动相，烟叶中的叶绿素-a、叶绿素-b、β-胡萝卜素、叶黄素、新叶黄素、紫黄质和脱镁叶绿素等色素分别在其最大吸收波长监测下分离提取，色谱峰面积定量。该方法标准回收率95％～105％，RSD为1.6％～2.5％。将其用于烟草中天然色素含量的测定，结果令人满意。
关键词：微柱高效液相色谱法；固相萃取；植物色素；烟叶
前言
植物色素是烟草中的重要天然化学物质之一，烟叶调制过程中色素降解是否完全和得当，将直接影响烟叶的香味和色泽。为此研究烟草调制过程中的色素变化规律对烟草质量的控制具有重要意义。烟草色素的测定常用分光光度法和液相色谱法，光度法准确性较差，传统的液相色谱法样品前处理较为麻烦且分离时间长。与常规高效液相色谱相比，微柱高效液相色谱具有流动相消耗少，分析时间短，可以不分流并能直接和质谱联用等特点，近几年来得到了迅速发展 。本文研究用Waters XterraTM RP18(1.0×50mm，Φ2.5μm)微柱为固定相的液相色谱法测定了烟草中的植物色素，烟草中的主要色素在4.0min内可达到基线分离。该方法用于烟草样品中植物色素的分析，取得满意结果。
1 实验部分
1．1 主要仪器和试剂
高效液相色谱一质谱联用仪(美国Waters公司)，包括2690分离系统(四元泵及自动进样器)，996(PAD)紫外二极管矩阵检测器，Millennium 色谱
管理软件；Mili-Q50超纯水处理仪(美国Millipore公司)。
1+1)甲醇-异丙醇溶液，甲醇和异丙醇均为色谱纯试剂(美国Fisher公司生产)；叶绿素-a、叶绿素-b、叶黄素、β-胡萝卜素、新叶黄素、紫黄质和脱镁叶绿素标准(Fluka公司生产，含量>95％)；水为石英亚沸蒸馏水并用Mili-Q50超纯水仪处理，水的电导率达一级水要求。
1．2 色谱条件
固相萃取柱为：Waters Sep-Park-C18固相萃取小柱；色谱柱：Waters XterraTM RP18(1.0×50mm，Φ2.5μm)液相色谱柱；流动相为：A(1+1)甲醇-异丙醇溶液，B水，体积比以0min(90％ A+10％ B)，3.5 min(100％A+O％B)线性递增的梯度条件洗脱。流速：0.2 mL/min；进样体积：2.0μL；检测波长分别为：叶黄素，444.9 nm；
β-胡萝卜素，452.1 nm；叶绿素-a，649.5 nm；叶绿素-b，664.2 nm；紫黄质，441.2nm；新叶黄素(新黄质)，442．4 nm；脱镁叶绿素，445．4nm；各组分均在最大波长下检测，在上述色谱条件下，标样和烟草样品在450nm波长处的色谱图。
1．3 样品处理
新鲜烟叶粉碎为浆状，干烟叶于粉碎机中粉碎，过0.1mm筛。称取0.2500g烟样，加入35ml90％丙酮振荡萃取30 min，过滤，滤渣再用lOml90％丙酮洗涤2—3次，至滤渣为白色。合并滤液，定容到5O ml。取lO ml，用水稀释到5Oml，以10 ml／min流速通过预处理好的Sep-Park-C18固相萃取小柱，富集结束，小柱离心脱水后，以10 ml／min流速用2.0 ml丙酮洗脱，洗脱液用0.45μm针头过滤器过滤，按上述色谱条件进样分析。
2 结果与讨论
2．1 样品前处理
2．1．1 样品中色素的提取
用90％的丙酮为提取溶剂，提取烟草中的植物色素。同时采取超声浸取、振荡浸取和加热回流提取等三种方法进行浸出对照实验，三种方法浸出率差别不明显。本实验选用振荡浸取。实验表明，对于0.25μm左右烟样，用3Oml以上的90％丙酮振荡萃取30min可使色素完全浸出。
2．1．2 固相萃取条件
实验用Waters Sep-Park-C18固相萃取小柱对色素进行吸附，然后用Waters SPE真空提取装置进行提取，每次可同时处理20个样。小柱先用5ml甲醇活化，再用30ml水洗去小柱上残留的甲醇，小柱活化和样品富集的流速均为10ml／min。浸出液用水稀释，通过降低溶剂强度来降低溶剂对色素的洗脱能力。如果用90％丙酮浸出液直接通过小柱，会因溶剂强度过大而使色素不能在C 。固相萃取小柱上充分保留。实验表明，随着溶剂强度的降低，色素在小柱上的保留增强，当样品浸出液稀释倍数达5倍左右再过柱，可使色素完全富集在小柱上。富集的色素可用洗脱剂洗脱。试验了甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃作洗脱剂洗脱小柱上的色素，发现用四氢呋喃或丙酮都能使色素完全洗下，但四氢呋喃溶剂强度过大，洗脱时会把样品中的蜡质和脂肪类物质也洗脱而达不到较好的
预分离效果，用丙酮做洗脱剂时蜡质和脂肪类物质被洗脱的量相对较少，能保证色素完全洗脱且较好的分离干扰组分，然后用2.0mL左右的丙酮可把富集在小柱上的色素完全洗脱。
2．2 分离条件的选择
植物色素的分离需用溶剂强度较强的流动相，四氢呋喃-水为最常用的体系，但四氢呋喃价格较高且溶剂过滤时会腐蚀滤膜；用甲醇作流动相时，β-胡萝卜素峰型较差，需加入其它调节剂如乙酸乙脂、异丙醇，氯仿等。本实验选用甲醇和异丙醇(1+1)溶液为流动相。实验表明，用梯度洗脱各色素能达到基线分离，且分析时间较短。我们试验了不同的梯度条件，合理梯度条件为：A(1+1)甲醇一异丙醇溶液，B水，按0min(90％ A+10％ B)，3.5 min(100％A+0％B)。
2．3 主要色素的定性及检测波长的选择
烟草样品中共检测出12个峰，由紫外二极管矩阵捡测器可得各主要色素峰的光谱图。叶黄素、β-胡萝卜素、叶绿素-a、叶绿素-b、紫黄质、新叶黄素(新黄质)可通过与标样色谱图和光谱图对照进行确认.
为了减少各组分的相互干扰和定量误差，各组分均在其最大波长下提取色谱图，并在该波长下提取色谱图的峰面积进行定量。各主要色素的检测波长分别为，叶黄素：444.9 nm，β-胡萝卜素：452.1 nm，叶绿素-a：649.5 nm，叶绿素一b：664.2nm，紫黄质：441.2nm，新叶黄素：442.4nm，脱镁叶绿素：445.4 nm；脱镁叶绿素只有少数样品能检出，其余成分因未购到相应标样，且因其含量太少，光谱图噪音太大而失真，无法与谱库对照而定性；保留时间为0.304的色谱峰为未分离混合成分，其最大吸收波长在340～420nm之间，其在色谱柱上的保留时间很短，为极性较大的化合物，估计为多酚氧化物或棕色化反应产物。
2．4 工作曲线及检测限
分别配制浓度为100μg／ml，20μg／ml，8μg／ml，0.8μg／ml，0.12μg／ml的各种植物色素标准溶液，进样后对不同浓度的峰进行峰面积积分，计算出回归方程，根据信噪比S／N=3，计算得各组分最低检测浓度。
2．5回收率及精密度
准确称取同种烟样A、B两份(共七组)，分别加入已知量不同种色素标样，在相同条件下测定 5次，通过对加入色素的测出量计算回收率，并根据5次平行测定的结果计算相对标准偏差。
2．6 样品分析结果
烟草样品按1．3样品前处理过程处理后，进样分析.
参考文献：
[1] 金闻博。戴亚．烟草化学[M]．北京：清华大学出版社。1993．
[2] 左天觉，朱尊权．烟草的生产、生理和生物化学[M]．上海：上海远东出版社，1993
作者：
2007-5-18