反相高效液相色谱法测定猪血浆中异丙酚浓度

    异丙酚是一种新型的静脉麻醉药．因其有起效快、时效短、苏醒迅速、副作用少等特点。欧、美国家2O世纪8O年代已开始应用。近年我国临床也越来越广泛应用于静脉麻醉，利用大动物实验了解异丙酚在大动物体内的药时变化规律。不同合并用药之间代谢的相互影响．以及不同临床治疗干预对药物浓度和药动学的影响。很多实验目前在人体还未曾被证明是安全的，因而大动物实验对于临床上更好地应用异丙酚提供理论依据有着重要的意义。目前国内外测定血浆中异丙酚的药物浓度采用的方法有气相色谱、液相色谱、气-质联用等方法。国内以液相色谱法较为普遍，但因实验条件不同．测定方法也各不相同．本实验建立了适合我院实验条件的测定猪血浆中异丙酚浓度的反相高效液相色谱方法。此法操作简单，灵敏度高．可适用于大动物实验的血药浓度测定。
    1 仪器与试药
    1．1 仪器 Waters高效液相色谱系统(2695型输液泵系统。2487紫外检测器系统，Millennium32工作站)；旋涡混合器(上海第一医用仪器厂XW-80)；离心机(北京医用离心机JLGlO-24A)。
    1．2 试剂 异丙酚标准品由英国阿斯利康制药有限公司提供。纯度为100％；麝香草酚、三乙胺、磷酸二氢钠均为分析纯；乙醚、甲醇均为色谱纯；重蒸水。
    2 方法与结果
    2．1 标准溶液配制 精密称取异丙酚标准品50mg于25ml容量瓶中，甲醇定容，得2mg／ml储备液。精密吸取储备液于1Oml容量瓶中，甲醇定容，配制成2、4、6、8、10、20、30、4Oμg／ml系列标准液。精密称取麝香草酚10 mg于100ml容量瓶中。甲醇定容。即得100μg／ml麝香草酚内标液。
    2．2 试剂溶液配制(1)磷酸盐缓冲液(pH 7.6)按中国药典(2000版)配制。(2)量取5Oml三乙胺。与5Oml乙醇混匀，即得50%三乙胺乙醇溶液。
    2．3 色谱条件 色谱柱Agilent ZORBAX Extend-C18；检测波长273nm；AUFS：0.0050；流动相为甲醇-水-β-环糊精(68：32：0.01)；柱温3O℃ ；流速1.0ml／min)进样量2Oμl。
    2．4 样品预处理
    取待测血浆(待测血浆应加入肝素钠抗凝试管4℃冷藏)1.0ml于1Oml离心管中，准确加入2Oμl麝香草酚内标液，加磷酸盐缓冲液1ml，混匀后再加入乙醚5ml，涡旋振荡2min，2500r／min离心15min。吸取乙醚层于另一加有5O% 三乙胺乙醇溶液5Oμl的离心管中，混匀，38℃水浴挥干后加100μl甲醇复溶。2Oμl进样。
    2．5 色谱图 结果显示异丙酚与内标完全分离。保留时间分别为6min、11min。
    2．6 标准曲线的制备 在1Oml离心管中分别加入1ml空白血浆。再分别加入异丙酚系列标准液100μl。按2．4项进行测定．求出异丙酚对内标的峰面积比与异丙酚浓度的回归方程。结果表明，异丙酚在0.1～4.0μg／ml浓度范围内线性关系良好，r=0.999 8。回归方程为Y=0.002680X+0.000558。异丙酚的最低检测浓度为0.1μg／ml。
    2．7 回收率、精密度试验 用空白血浆分别配制浓度为0.2、1.0、4.0μg／ml的血样。照2．4项操作。进样2O μ1分析；每个浓度的样品测定5次。将测定的异丙酚峰高与内标峰高比入回归方程求得浓度。按测定量／添加量×100％计算回收率。分别配制浓度为0.2、1.0、4.0μg／ml的血样，每个浓度的样品同一天内不同时间重复测定5次，同批血样连续测定5日。按血药浓度测定日内、日间的精密度值。
    3 讨论
    3．1 血浆样品预处理方法 目前血液中提取异丙酚主要的方法有萃取法和沉淀法。通过实验比较，萃取法较沉淀法更加适合血浆中提取异丙酚。首先，沉淀法提取率低，低浓度血浆样品无法检测，通过配制含不同浓度异丙酚标准血样，经提取后再加内标，测定其峰高比R1，同法测定不经提取的标准异丙酚加内标的峰高比R2．按R1／R2×100%方法计算绝对提取率，沉淀法绝对提取率不到50%(n=6)，而本实验中采用乙醚进行萃取，绝对提取率≥85%（n=6)。其次沉淀法无法将血浆中杂质清除．对实验干扰较大，并且对色谱柱有很大影响．我们发现采用沉淀法提取进样，柱压上升过快，实验中进样50次柱压便从1200上升到2000以上，无法很好地控制实验条件，因而影响实验的准确性。萃取法多采用环己烷 、二氯甲烷等有机溶剂对血浆中异丙酚进行提取，但用于猪血浆极易乳化。本实验采用乙醚进行提取。选择性强。不易乳化。提取率高，易挥发，提取简便，耗时较少，适合大样本量的检测。异丙酚较易挥发，在提取中极易丢失，因而导致了本实验中日间变异较大。提取之后的乙醚中加入适当的碱性有机溶液，再进行挥干对于防止异丙酚丢失和提高提取率有很大作用。一般都是采用氢氧化四乙氨(氢氧化四甲氨)，但我们未能购到此试剂，采用易购到的三乙胺乙醇溶液代替，也获得了较好的结果。
    3．2 色谱条件的选择本实验采用Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱；通过对乙腈-水、甲醇-水组成的流动相进行的比较，并对流动相的比例进行调整．最终选择甲醇-水-β环糊精(68：32：0.01)作为流动相，获得了较好的分离效果， 环糊精的加入可获得较好的峰形。
参考文献：
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