摘 要 建立了一种检测人尿中神经鞘氨醇（So）和二氢神经鞘氨醇（Sa）的高效液相色谱方法(HPLC)。离心分离尿样中的片状剥落细胞，裂解后用乙酸乙酯萃取、邻苯二甲醛衍生，在HPLC系统中通过梯度洗脱用Nova-Pak C18-RP色谱柱（15 cm×3.9 mm, 4 μm）分离、荧光检测器检测。So和Sa的检出限均为0.05 ng（女性尿样0.075 μg/L、男性尿样0.005 μg/L）。分析从我国一个村庄采集的40份尿样，女性尿样中So、Sa和Sa/So比值分别为1.29～13.58 μg/L、0.25～3.13 μg/L和0.15～0.25，男性尿样中分别为0.075～3.07 μg/L、0.019～0.50 μg/L和0.028～0.26。
Abstract An improved liquid chromatographic method for the determination of sphingosine(So) and sphinganine(Sa) in human urine was developed. It involves isolation of exfoliated cells from human urine followed by a rapid and efficient extraction of sphingolipid bases in ethylacetate, and a derivatization step with o-phthaldialdehyde and a high performance liquid chromatographic separation on a 15 cm×3.9 mm, 4 μm Nova-Pak C18-RP column, with a phosphate buffer/methanol gradient. Fluorescence was monitored at 335 nm for excitation and 440 nm for emission. The limits of detection were 0.05 ng or 0.075 μg/L in female urine and 0.005 μg/L in male urine. The method was applied to analyze 40 human urine samples collected from a village in China. The So, Sa and Sa/So ratio in female urine varied from 1.29～13.58 μg/L, 0.25～3.13 μg/L and 0.15～0.25, respectively, while those in male urine varied from 0.075～3.07 μg/L, 0.019～0.50 μg/L and 0.028～0.26, respectively.
1 引 言
伏马菌素（fumonisins）是一组主要由串珠镰刀菌产生的
真菌毒素，普遍污染玉米等粮食作物〔1〕。它们可引起马脑白质软化症(equine leukoencephalomalacia)和肝脏毒性作用、猪肺水肿综合征(porcine pulmonary edema)及大鼠
肝癌等动物疾病，还可能与人类食道癌有关。
近年研究发现伏马菌素是神经鞘氨醇（sphingosine, So）和二氢神经鞘氨醇（sphinganine, Sa）N-酰基转移酶的有效抑
制剂，它们通过抑制神经鞘脂类的生物合成而干扰细胞生长、分化和
肿瘤转化的调节。这些效应已在马、猪、大鼠、鲶鱼等动物实验中得到证实。肾脏是伏马菌素作用的主要靶器官之一，尿中Sa/So比值的升高被作为评价动物或人接触伏马菌素的生物指标〔2，3〕。Castegnaro等〔4〕、Solfrizzo等〔5〕分别建立了检测人尿中So和Sa的高效液相色谱方法（HPLC），但这两个方法都存在一个共同的问题，即男性尿中的Sa因含量低往往不能检出。本研究通过优化分离、检测条件，成功地解决了这一问题，并分析了部分人尿样品。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Waters液相色谱系统：600系统控制器、600泵、474荧光检测器、PC800工作站。色谱柱：Nova-Pak C18-RP,4 μm（15 cm×3.9 mm）。
So、Sa标准溶液：将So、Sa标准品 (Sigma公司)溶于甲醇，制成标准储备液（100 mg/L），保存于-20℃，标准应用液临用前稀释。邻苯二甲醛（OPA）衍生溶液：取50 mg邻苯二甲醛溶于1 mL甲醇，加入50 μL 2-巯基乙醇及50 mL 0.05 mol/L Na2B4O7溶液，混匀备用。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
2.2 色谱条件
流动相A为0.07 mol/L K2HPO4-甲醇(1:9，V/V)；流动相B为甲醇。流速1.0 mL/min。梯度洗脱30 min，其中0～4 min，使用100%流动相A；4～12 min，逐步变为60%A、40%B；12～15 min，再逐步变为100%B；15～20 min，维持100%B；20～22 min，逐步变为100%A；22～30 min，维持100%A。荧光检测器的激发波长为335 nm，发射波长为440 nm。进样量50 μL。
2.3 样品前处理、测定
取适量混匀尿样（女2～4 mL、男20～60 mL）离心收集沉淀(内含片状剥落细胞)，加2 mL水悬浮，然后加入50 μL 1 mol/L KOH溶液,用乙酸乙酯萃取2～3次(每次2 mL)。合并萃取液，在60℃水浴中用氮气吹干，溶于250 μL 0.07 mol/L K2HPO4-甲醇(1:9,V/V)。加入50 μL OPA衍生溶液，反应30 min后进行液相色谱分析。
3 结果与讨论
3.1 标准曲线、检出限、加标回收率
在0.1～3.0 ng范围内，So和Sa的绝对进样量x（ng）与峰面积y（105 μV.s)有良好的线性关系。回归方程分别为So：y=55.56x+0.0091(r=0.9996），Sa：y=86.21x-1.1121（r=0.9999）。以信噪比为3计算,检出限为0.05 ng，推算到样品即为女性尿样0.075 μg/L、男性尿样0.005 mg/L。
在尿样中加入So和Sa标准溶液，重复测定5次，计算回收率。结果So、Sa的加标回收率分别为89.5%±7.2%和84.7%±9.6%。
3.2 样品色谱图
尿样的色谱图如图1，So、Sa的保留时间分别约为5.7 min、7.8 min。图1显示，男性和女性尿样中So、Sa均能得到良好分离。
图1 尿样的典型色谱图
Fig.1 Typical chromatograms of human urine
1.So (sphingosine)；2. Sa(sphinganine)。a.男（male）；b.女（female）。
3.3 样品分析
分析从我国河南省一个村庄采集的40份晨尿样品（男性21份，女性19份），结果如表1。人尿中So、Sa值表现出明显的性别差异，女性大大高于男性，其含量中位数值分别为So 2.45、0.92 μg/L，Sa 0.50、0.07 μg/L。同一性别内不同个体间So、Sa含量差别很大，而Sa/So比值则相对稳定，其中位数值分别为女性0.20、男性0.10。
表1 人尿样品中So、Sa、Sa/So比值测定结果
Table 1 Results of the So, Sa and Sa/So ratio in human urine
性 别
Sex 样品数
Number of samples So (μg/L) Sa(μg/L) Sa/So
中位数(范围)
Median(range) 中位数(范围)
Median(range) 中位数(范围)
Median(range)
男性 Male 21 0.92(0.075～3.07) 0.07(0.019～0.50) 0.10(0.028～0.26)
女性 Female 19 2.45(1.29～13.58) 0.50(0.25～3.13) 0.20(0.15～0.25)
3.4 结论
本方法是基于尿中片状剥落细胞（exfoliated cells）含有75%So和95%Sa的原理而建立的〔3〕。在Castegnaro等〔4〕研究的基础上，我们通过改变色谱柱（原为Kromasil C18柱，25 cm×4.6 mm ，5 μm）并优化其它条件，使保留时间减少了近一半，灵敏度提高，所有男性尿样中的Sa均可检测定量。通过样品分析，对我国部分人群尿中的So、Sa及Sa/So水平有了一定的了解，为今后开展我国高危人群对伏马菌素接触状况的研究准备了条件。
本文系国家自然科学基金资助项目(No,39500121)
作者单位：邱茂锋（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050）
刘秀梅（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050）
王玉华（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050）
刘江（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050）
References
［1］ Shephard G S, Thiel P G, Stockenstrom S, Sydenham E W. J. AOAC Int., 1996, 79（3）：671～687
［2］ Wang E, Ross P F, Wilson T M, Riley R T, Merrill A H Jr. J. Nutr., 1992, 122:1706～1716
［3］ Riley R T, Hinton D M, Chamberlain W J, Bacon C W, Wang E, Merrill A H Jr, Voss K A. J. Nutr., 1994，124:594～603
［4］ Castegnaro M, Garren L, Gaucher I, Wild C P. Nat. Toxins, 1996, 4:284～290
［5］ Solfrizzo M, Avantaggiato G, Visconti A. J. Chromatogr. B, 1997, 692:87～93
作者：
2007-5-18