摘 要 研究柱后光化学衍生荧光检测高效液相色谱分离测定食品中维生素B1的方法。采用C18柱，以含有2%乙腈的pH 4.0磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L）作流动相反相分离，猪肝等食品中的维生素B1可与其它杂质达到完全分离。色谱流出液在柱后与0.75% Na2SO3-4% NaOH的混合试剂溶液在线汇合后流经一聚四氟乙烯(PTFE)细管制成的光化学反应器时，维生素B1转化为强荧光产物，由荧光检测器测定。在最佳条件下，进样20 μL检测限为3.8 μg/L，工作曲线的线性范围为0.033～10 mg/L，相对标准偏差(RSD)为 1.8%，标准加入回收率为97%～102%。所建立的方法用于鲜猪肝和奶粉中维生素B1的测定，取得了满意的结果。
Abstract A high performance liquid chromatographic method with post-column photochemical derivation and fluorescence detection was developed for the analysis of thiamine in foods. A C18 column was used for separation, and elution was performed with a pH 4.0 phosphate buffer (0.1 mol/L) containing 2% acetonitrile. When the eluate was on-line converged with a mixed 0.75% Na2SO3-4% NaOH solution, thiamine in the eluate was transferred to an intensive fluorescence compound by post-column photochemical derivation that occurred in a knotted polytetrafluoroethylene reactor, and detected by a spectrofluorimetor. Under optimized conditions, a detection limit of 3.8 μg/L thiamine was achieved with the injection volume of 20 μL, and a linear calibration curve was obtained in the range of 0.033～10 mg/L thiamine. RSD was in the level of 1.8%, and the recoveries of spiked analyte were in the range of 97％～102%. The developed method was applied to determine the thiamine contents in pork liver and milk powder, and satisfactory results were obtained.
1 引 言
测定食品中维生素B1（VB1）的经典方法是经离子交换柱分离共存的干扰物质后，在强碱性条件下，用K3Fe(CN)6将其氧化为硫色素，再经异丁醇萃取、荧光光谱法测定〔1〕。该法操作繁琐、费时， 且须使用有毒、有害试剂。近来，采用荧光检测的高效液相色谱（HPLC）测定食品中VB1的方法由于操作简便快速、灵敏度高、干扰小而越来越受到人们的重视。但不论采用柱前〔2，3〕还是柱后〔4，5〕化学衍生，均离不开有毒试剂K3Fe(CN)6。
光化学荧光法〔6〕是以光子作为衍生试剂的新颖的荧光分析法。Guo等〔7〕首先报道了VB1的光化学荧光现象，建立了不用任何氧化剂的原位光化学荧光光谱法。我们〔8〕进一步研究了VB1的在线光化学荧光反应，并应用于流动注射在线光化学荧光光谱法测定多种药物
制剂及血清中的VB1。
本文在文献〔8〕的基础上，研究建立HPLC分离-柱后光化学衍生-荧光检测法测定食品中微量VB1的方法。
2 实验部分
2.1 仪器
液相色谱分离系统由Beckman-114高压泵、Alltima-C18色谱柱(粒径5 μm, 4.6 mm×25 cm)和Beckman 四通进样阀组成；岛津RF-540荧光光谱仪配置9 μL石英流通池作为荧光检测器；柱后光化学反应器按文献〔9〕的方法自制，所用的光源为6 W低压紫外汞灯（最大辐射波长253.7 nm），编结反应器由内径0.5 mm 长75cm的PTFE管编成。Rabbit蠕动泵（法国Rainin公司）。
2.2 试剂
维生素B1标准储备液（1.00×103 mg/L的0.01 mol/L HCl溶液）， 配置于棕色瓶中，冰箱保存。NaOH-Na2SO3混合试剂溶液，1.5 g Na2SO3溶于200 mL 4 % NaOH溶液，当天配制。色谱流动相， 20 mL乙腈+980 mL pH 4.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液。
2.3 试样制备
奶粉：准确称取10 g奶粉于250 mL锥形瓶中，加入70 mL 0.1 mol/L的HCl溶液，摇匀后，置于高压锅（1MPa）中水解30 min。冷却后，取出，滴加6 mol/L NaOH至pH 5～6, 转入100 mL容量瓶后，用水定容。过滤，弃去初滤液，收集续滤液备用。
猪肝：新鲜猪肝洗净后，捣碎。准确称取13 g捣碎的猪肝于250 mL锥形瓶中。以下与奶粉的处理方法相同。
2.4 操作步骤
置荧光光谱仪的激发和荧光波长分别于370 nm和440 nm，激发和荧光狭缝为5 nm。打开光化学反应器的紫外灯，启动高压泵和蠕动泵分别泵入流动相和NaOH-Na2SO3混合溶液。待基线平直后，用微量注射器取经0.3 μm 滤膜过滤后的20 μL制备液进样。记录色谱峰。每个试样平行测两次，以平均峰面积外标法定量。
3 结果和讨论
3.1 方法设计
柱后衍生HPLC分离测定食品中VB1时，多采用反相离子对色谱的分离模式〔5〕。以这种方式分离，流动相中甲醇等溶剂的含量较高，会对柱后光化学衍生产生负面影响〔8〕；而且反相离子对色谱需使用价格昂贵的对离子试剂己烷磺酸钠。考虑到VB1虽为离子化合物，但分子中仍有较大的疏水性母体，因此，本文试用 C18柱以一般的反相模式进行分离。
图1 实验装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of the experimental set-up
C.C18分离柱（separation column）, 4.6 mm×25 cm; D.荧光检测器（fluorescence detector）, λex, 370 nm, λem, 440 nm; E．流动相（mobile phase, 0.1 mol/L pH 4.0 phosphate buffer containing 2% acetonitrile,）, 1.0 mL/min; K.编结反应器（knotted reactor made of 0.5 mm×75 cm PTFE tubing）; L.6W低压汞灯（6 w low pressure mercury lamp）;P1．高压泵（high pressure pump）; P2．蠕动泵（peristaltic pump）; R．混合试剂溶液（0.75% Na2SO3-4 %NaOH mixed solution）, 0.5 mL/min; S. 试样溶液（sample solution）, 进样体积（injection volume），20 μL; V. 进样阀（injection valve）; W.废液（waste）。
VB1的光化学反应需在强碱性条件下进行，而还原剂亚硫酸钠对该反应有明显的增敏作用〔7，8〕。因此，本文使含有亚硫酸钠的氢氧化钠溶液与色谱流出液在柱后汇合后，再流经光化学反应器。为减少柱后谱带的扩张和过份的稀释作用，流动相和Na2SO3-NaOH混合试剂溶液的流量比设计为1∶0.5 ，且将光化学反应器制成编结状〔9〕。按此思路所设计的实验装置见图1。
3.2 流动相的优化
以鲜猪肝提取液为试样，对流动相的组成进行了优化。发现用磷酸盐缓冲体系峰形较醋酸盐好；以磷酸盐缓冲液-乙腈作为溶剂体系所得的VB1峰高较用同浓度的磷酸盐-甲醇体系高4～6倍。
图2 鲜猪肝制备液的色谱图
Fig.2 A typical chroma-
togram for the sample of pork liver
保留时间5.23 min的峰为维生素B1(the peak with retention time of 5.23 is for thiamine)。
这是因为甲醇对VB1的光化学反应有抑制作用〔8〕。在磷酸盐缓冲液中乙腈浓度大于10%时，VB1很快流出而不能与杂质分离；当乙腈浓度在2%左右，磷酸盐缓冲液的pH值在4.0时，VB1可与猪肝中的杂质完全分离；pH 4.0磷酸盐缓冲液的浓度在0.05～0.2 mol/L之间变化，以浓度为0.1 mol/L时，柱效、分离度和灵敏度均可兼顾，而且峰形良好，见图2。
3.3 柱后光化学衍生条件的优化
3.3.1 化学条件 分别试验了NaOH和Na2SO3的浓度对柱后光化学反应的影响， 结果如图3a和图3b所示。可见， NaOH浓度在4% 、Na2SO3浓度在0.5%～1.0％间，荧光检测的灵敏度最高。故选择0.75% Na2SO3-4% NaOH的混合溶液作为柱后衍生的试剂。
图3 混合试剂中NaOH和Na2SO3的浓度对柱后光化学衍生荧光强度的影响
Fig.3 The influences of NaOH and Na2SO3 concentrations in the mixed reagent solution on the fluorescence intensity of post-column photochemical derivation
a. NaOH浓度的影响，Na2SO3浓度为0.75%（0.75% Na2SO3 with variable NaOH concentrations）; b．Na2SO3浓度的影响，NaOH浓度为4%（4% NaOH with variable Na2SO3 concentrations）。
3.3.2 物理条件 在固定流速的条件下，VB1在柱后光化学反应中接受光照的时间受光化学反应器的管长所控制。研究了编结反应器管长对VB1峰高的影响，发现管长在50～100 cm间测定VB1的灵敏度最高。本实验选用长75 cm的PTFE管（内径0.5 mm）编制成编结反应器〔9〕后，自由地盘绕在6 W紫外灯管上作为光化学反应器。与柱后化学衍生法相比较〔4，5〕，光化学衍生反应由于速度快〔7，8〕，所需的反应器管长较短，可减小柱后的谱带扩张，有利于分离效率和灵敏度的提高。
3.4 线性范围、检测限、精密度和回收率
在图1所示的最佳条件下， VB1的线性范围为0.033～10 mg/L，线性回归方程为A=1.78+26.9C（A为峰面积，C为VB1浓度, mg/L），相关系数r=0.9994；检测限（S/N=3）为3.8 μg/L；1.2 mg/L 的VB1 试液11次测定的RSD为1.8% 。每10 g奶粉中加入0.1 mg VB1后测得的回收率为102%±7%（n=3），每13 g鲜猪肝中加入0.05 mg VB1后测得的回收率为96%±7%（n=3）。分析速度约为8次/h。本法的检测限与柱前化学衍生法〔2〕相似，但由于无须HPLC测定前的氧化、萃取等手工操作步骤〔2，3〕，其精密度、回收率、分析速度等优于后者。
表1 猪肝和奶粉中维生素B1的测定
Table 1 Determination of results thiamine in pork liver and milk powder
试 样
Sample 测得含量，Found(μg/g）
本法（n=3）
This method 柱前衍生HPLC法〔3〕（n=2)
Precolumn derivation- HPLC method#
鲜猪肝 Fresh pork liver 2.06±0.05 2.20 2.26
奶粉 Milk powder 8.63±0.17 8.71 8.50
*以平均值±标准偏差表示（expressed by mean±S.D.），# 以平行测定的个别值表示（expressed by individual results）。
3.5 应用
应用所建立的方法测定了鲜猪肝和奶粉试样中的VB1，并与柱前衍生反相HPLC法对照，结果一致，见表1。
4 结 论
柱后在线光化学反应可以方便地将维生素B1衍生为荧光化合物。与化学衍生法相比较，本法不使用含有毒成份K3Fe(CN)6的不稳定试剂溶液，而且灵敏度高、精密度好、操作简便、自动化程度高。采用反相色谱法分离，流动相中有机溶剂的用量大大减少，既降低了分析成本，也减少了环境污染。所建立的方法可用于奶制品、肉类等食品中维生素B1的测定。
致 谢 感谢我系徐秀珠教授对本文的建议和帮助。
本文系浙江省分析测试基金资助课题
任一平（浙江省轻工研究所食品检测站，杭州 310009）
陈恒武（浙江大学化学系，杭州 310028）
陈青俊（浙江省轻工研究所食品检测站，杭州 310009）
包敛彬（浙江大学化学系，杭州 310028）
（浙江省轻工研究所食品检测站，杭州 310009）
黄百芬（浙江省轻工研究所食品检测站，杭州 310009）
何巧红（浙江大学化学系，杭州 310028）
References
1，Williams S(Editor). Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 14th ed., Association of Official Chemists, Inc., Virginia, 1984:836
2，Ang C Y W, Moseley F A. J. Agr. Food Chem., 1980, 28: 483～486
3，Chinese Standard（中华人民共和国国家标准）. GB/T5413.11-1997, Milk Powder and Formula Foods for Infant and Young Children, Determination of Vitamin B1 Contents, Method 2-HPLC Method（婴幼儿配方食品和乳维生素B1的测定，方法2-高效液相色谱法）. 1997
4，Bognar A．F. J. Anal. Chem.，1992, 343:155～156
5，Hideaki O, Toshiro B, Yoshihiko S．J. Chromatogr.， 1984, 284: 573～575
6，Guo X J（郭祥群），Xu J G（许金钩），Chen G Z（陈国珍）．Chinese J. Anal. Chem.（分析化学），1991，19：244～252
7，Guo X J, Xu J G, Wu Y Z, Zhao Y B, Huang X Z, Chen G Z．Anal. Chim. Acta, 1993, 276:151～160
8，Chen H W, Zhu J P, Cao X X, Fang Q J．Analyst, 1998, 123:1017～1021
9，Zhu J P（朱京平），Chen H W (陈恒武)，Fang Q J (方琼君)．Chinese J. Anal. Chem. (分析化学)，1997，25：573～575
作者：
2007-5-18