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摘要 目的:建立用反相离子对色谱法测定马来酸噻吗洛尔及其滴眼液中有关物质的方法。方法:采用国产YWG-C18柱,0.065%辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液-乙腈(70∶30)为流动相,检测波长297
nm。结果:该方法在3.0~11.2
μg.mL-1范围内,峰面积与浓度呈良好的线性关系(r=0.999
3)。结论:该方法简便、快速、准确,优于薄层法。 Determination
of Related Substances in Timolol Maleate and Huo
Xiumin Abstract Objective:A
reversed phase ion-pair HPLC method was developed of the determination of
related substances in timolol maleate and its eye drops.Methods:The
analysis was carried on an ODS column.The mobile phase consisted of 0.065%
sodium octylsulphonate phosphate buffer-acetonitrile(70∶30).Detection was
at 297 nm.Result:The good linearity was obtained between peak area and
concentration ranging from 3.0~11.2
μg.mL-1(r=0.999 3).Conclusion:The
method was proved to be simple,rapid,and accurate.And better than thin
layer chromatography method. 马来酸噻吗洛尔是一种非选择性β-肾上腺能阻滞剂,有明显降低眼内压的作用,其滴眼液治疗原发性开角型青光眼及无晶状体青光眼在临床上得到广泛应用。中国药典1995年版收载了原料药及其滴眼液[1],USP Ⅹ 也有收载[2],均采用薄层层析法,其有关物质的检查,BP 1993[3]是采用高效液相色谱法,但使用国产C18柱按其色谱条件不能得到理想的色谱图,本实验经过对多种色谱条件的筛选,采用反相离子对高效液相色谱法,可以快速、准确地进行样品测定。 1 仪器、药品与试剂 岛津LC-10AD泵,SPD-10A紫外检测器,CTO-10A柱温箱,C-R6A数据处理机。 2 色谱条件 色谱柱:YWG-C18(10 μm,4.6 mm×250 mm);流动相:0.065%辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液[取磷酸二氢钠1.56 g,加水1000 mL,用磷酸(1→10)调节pH至3.50±0.05,加入辛烷磺酸钠0.65 g使溶解,摇匀]-乙腈(70∶30);流速:0.7 mL.min-1;检测波长:297 nm;积分仪衰减:0;纸速:1.5 mm.min-1;灵敏度:0.05 AUFS;柱温:40 ℃,理论板数不低于2 000。 3 实验方法 3.1 色谱条件的选择 经过对不同磷酸盐、不同浓度(0.02,0.01,0.005 mol.L-1)缓冲溶液与甲醇或乙腈以不同配比(65∶35,70∶30,75∶25)筛选,并对加入不同离子对试剂(己烷磺酸钠及辛烷磺酸钠),比较其不同浓度(0.085%,0.065%,0.045%),不同pH条件(pH=3.0,pH=3.5)。最终选择0.01 mol.L-1磷酸二氢钠缓冲液[用磷酸(1→10)调pH=3.5]配制的0.065%辛烷磺酸钠溶液与乙腈(70∶30)组成的流动相为最佳条件(图1)。另以流动相溶解原料作紫外扫描,最大吸收297 nm为检测波长。 |
图1 原料药(A)及滴眼液(B)色谱图 3.2 线性实验 精密取马来酸噻吗洛尔适量(约相当于噻吗洛尔12.5 mg)置200
mL量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度。分别精密取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL置25 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,进样20
μL,以浓度(μg.mL-1)为横坐标,以峰面积为纵坐标,得到噻吗洛尔的回归方程: |
图2 中间体图谱 3.4 精密度实验 精密称取马来酸噻吗洛尔(980102批)适量(约相当于噻吗洛尔12.5
mg),置25
mL量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,重复进样6次,噻吗洛尔RSD=0.35%,马来酸RSD=0.44%,有较好的精密度。 表1 光照对样品的影响(n=3) |
样 品 | 初始含量/% | 光照后含量/% | 结论 |
原料药 | 99.2 | 99.2 | 稳定 |
滴眼液 | 98.8 | 86.6 | 不稳定(杂质峰增多) |
图3 光照27
d色谱图 3.6 本法与TLC法的比较 按照中国药典1995年版马来酸噻吗洛尔原料药有关物质TLC法对2批原料及滴眼液(980502批),光照7 d及27 d的样品进行测定,与本方法比较结果见表2。结果表明HPLC法比TLC法分析灵敏度高且能准确定量,TLC法检出的杂斑数较少且不容易判断结果。 表2 HPLC法与TLC法检查有关物质的比较 |
样品 | 批号 | HPLC法 (杂峰数) |
TLC法 (杂斑数) | |
原料药 |
960302 960401 |
1 1 |
未检出 未检出 | |
滴眼液 |
980502 |
(光照7 d) (光照27 d) |
4 8 |
1 3 |
4 样品测定
4.1 原料药 取本品(约相当于噻吗洛尔12.5
mg),精密称定,置25 mL量瓶中,加流动相使溶解并稀释至刻度,作为供试品溶液。精密取供试品溶液1 mL,置100
mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。取对照溶液20
μL注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分色谱峰高约为记录仪满量程的10%~20%,再取供试品溶液20
μL注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍(主成分保留时间应在10
min后),除马来酸峰之外,供试品溶液的色谱图中如有杂质峰,量取各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的峰面积。结果见表3。 表3 样品有关物质测定结果 |
样品 | 批号 | 对照峰面积(n=3) | 杂质峰面积之和 | 杂质量/% |
原
|
960401 960402 910302 910401 980102 |
5082 5332 5120 5120 4584 |
— — 24 24 — |
— — 0.004 0.004 — |
滴 眼 液 |
970601 980501 980502 980306 980504 |
5146 4807 4862 5554 5014 |
3092 1672 1922 1422 1560 |
0.60 0.35 0.40 0.26 0.31 |
5 讨论
5.1 实验中流动相比例的调整,以主峰保留时间在10
min之后为宜,马来酸峰与相邻杂质峰基线分离较好。 霍秀敏(天津市药品检验所 300070) 参考文献 1,中国药典.1995.二部:46 (本文于1999年4月16日收到) |