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摘 要 对新药小柴胡汤颗粒剂中柴胡皂苷的高效液相色谱分析方法进行了研究,考察了流动相对分离的影响,以柴胡皂苷b2(C42H68O13)计算本品中柴胡总皂苷含量。其检测波长为250nm,在所测范围内,峰面积与被测物浓度的线性关系良好。柴胡皂苷比的平均回收率为98.18%,RSD<2.4%(n=5)
关键词 小柴胡汤颗粒剂 高效液相色谱法 柴胡皂苷
小柴胡汤口服液已广泛用于国内临床,具有和解少阳之功效。为了扩大其应用范围,我们研制了小柴胡汤颗粒剂,关于其中柴胡皂苷薄层色谱法国内已有报道,但尚未见其HPLC含量测定的报道。我们采用C18柱,建立了小柴胡汤颗粒剂的柴胡皂的HPLC含量测定方法。
1 仪器与试剂
日本岛津LC-4A高效液相色谱仪,SPD-SAM紫外检测器,C-R3A数据处理机。
磷酸二氢钾、甲醇,均为分析纯。
柴胡皂甙b2对照品,日本和光纯药工业株式会社提供(含量为99.20)
小柴胡汤颗粒剂,华东中药工程公司提供(批号941021、960528、960627)
2 实验条件
2.1 色谱条件
色谱法:YWG-C18分析柱(5um,200mmX4.5mm i.d)大连化学物理研究所;流动相:0.1mol/L磷酸二氢钾-甲醇(75:25);流速0.8ml/min;检测波长250nm;进样体积10ul,柱温为室温。
2.2 样品预处理
取本品6g,精密称定,加蒸馏水30ml;超声10分钟,静置,精密吸取上清液20ml加样于已处理的聚酰胺柱(过三号筛,12g,内径20mm)上,待样品液吸干后,加蒸馏水150ml洗脱,再加甲醇1OOml洗脱,收集甲醇洗脱液,回收甲醇至干,残渣加水饱和的正丁醇,于80℃水浴加热溶解6次,第1次2ml.其后每次1ml,滤过,合并正丁醇液至分液漏斗中,加入正丁醇饱和的5%氢氧化钠10ml,摇匀,静置分层,弃去碱液层,用移液管将正丁醇液吸入10ml量瓶中,用水饱和的正丁醇洗涤容器3次,每次1ml,洗涤并入量瓶;加正丁醇至刻度,摇匀,备用。
3 方法与结果
3.1 色谱行为与系统适用性试验:
根据处方,照2.2项下方法制备样品溶液和空白样品液,照2.1项色谱条件进样,HPLC色谱图显示柴胡皂苷b2的保留时间约为15min。颗粒剂中其它成份对柴胡皂苷b2不产生干扰。在该色谱条件下,按柴胡皂苷b2峰计算色谱柱的理论板数为2000。
3.2 线性范围
取柴胡皂甙b2对照品用甲醇配制成21.8ug/ml,分取1,2,3,4,5,6,7,8,9,1Oul进样,以柴胡皂甙b2的进样浓度(C)对相应峰面积(A)进行线性回归,得回归方程=1.236x10-4+2.53C r=0.9999。可见,柴胡皂苷在21.8-218ug/ml范围内,线性关系良好。
3.3 检测波长的进择
柴胡中有效成份柴胡皂甙a、c、d均仅在203nm有最大吸收,而在紫外末端吸收处,本品有其它成份均有强吸收。故很难选择性地测定柴胡皂苷a、c、d,而有效成分柴胡皂苷b2具有二烯型结构,在250nm有最大吸收,其他成分对测定无干扰。故以柴胡皂苷b2来计算制剂中柴胡总皂苷含量。
3.4 回收率测定
取960528批号样品5份,每份6g,精密称定,分别加入柴胡皂苷b2对照液(0.408m切ml)各0·6:0.8:1.0:1.2:4m1后,照2.2项下,操作依法计算回收率,结果见表1。
3.5 样品测定
取三个批号的九份样品,分别照2.2项下操作制备样品溶液,照2.1项下色谱条件,按外标法以峰面积计算。0.0074士0.0003%,0.0065士0.0002%,0.0073士0.0003%(n=3)。
3.7 精密度试验
取960627批样品,照3.6项下操作,连续进样6次,测定峰面积,RSD为0.76%。
3.8 重现性试验
分别取960627批样品6份,照3.6项下操作将6份样品含量测定结果计算得RSD为2.01%。
表I回收率测定
样品编号 |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
加入量 |
0.2448 | 0·3264 | 0.4080 | 0.4896 | 0.5712 |
测得总量(mg) | 0.2395 | 0.3242 | 0.4046 | 0·4762 | 0.5559 |
回收率% | 97.82 | 99.34 | 99.17 | 97.26 | 97.32 |
平均回收率% |
98.18 | ||||
RSD | 2.34 |