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湖南医科大学附二院药剂科,长沙
410011
湖南医科大学药学系,长沙
410078
湖南中医学院药学分院
长沙 410007 |
[摘要] 目的:建立一种HPLC法测定虎梅冲剂中大黄素和大黄素甲醚的含量。方法:用氯仿提取;高效液色谱法用SupelcosilTMC8分析柱(150mm×4.6mm,5mm),流动相为甲醇-水(333:156),用磷酸调pH值至2.5,检测波长为254nm。结果:大黄素回归方程为Y=30518.0X+35607.0
r=0.9999 (n=6),线性范围为28.7~129.0mg.ml-1,平均回收率为98.7%,RSD为2.5%,大黄素甲醚回归方程为Y=31550.0X-3063.1,
r=0.9998 (n=6),线性范围为9.2~30.7mg.ml-1,平均回收率为98.6%,RSD为3.1%。结论:该法简便,准确,重现性好,可作为该制剂的质量控制方法。
[关键词] RP-HPLC;虎梅冲剂;大黄素;大黄素甲醚 虎梅冲剂是本院研制的一种复方中药制剂,由乌梅、虎杖等药材提取有效成分而制成,具有抗菌消炎、润肺止咳、清咽喉功效,主要用于急慢性咽喉炎的防治。君药虎杖中主要成分大黄素、大黄素甲醚能明显抑制金黄色葡萄球菌、肺炎球菌,是虎梅冲剂中主要有效成分,可作为质量控制的指标。至今,关于虎杖成份高效液相色谱法测定的报道极少,本文从提取条件、流动相组成等方面进行了较详细的考察,建立了HPLC法同时测定虎梅冲剂中大黄素、大黄素甲醚含量。
1. 仪器与试药 岛津LC-9A型高效液相色谱仪,浙江大学研制N2000色谱工站;SPD-6AV紫外可见检测器,KQ-600型超声波清洗器。
甲醇为光谱纯,水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯;大黄素,大黄素甲醚购自中国药品生物制品检定所;乌梅、虎杖由本院中药房提供,虎梅冲剂为本院药剂科制备。
2. 色谱条件 SupelcosilTMC8分析柱(150mm×4.6mm,5mm),灵敏度为0.02AUFS,流动相为甲醇-水(333:156),用磷酸调pH至2.5;流速1.2ml.min-1,检测波长254nm;柱温:室温;进样量20mL;理论塔板数按大黄素峰计算为2880。 |
3. 试验方法
3. 1提取条件选择 精密称取样品适量,按文献[1,2,3,4]分别用1(水煎煮法)、2(甲醇超声法)、3(乙醇回流法)、4(氯仿回流法)四种方法提取,进样测定,以1g
虎梅冲剂所对应的大黄素、大黄素甲醚峰面积为纵坐标(Y轴),以不同提取方法为横坐标(X轴),得图1;图中结果表明,氯仿回流法最佳,故作为本文的提取方法。
图 1 A-大黄素,B-大黄素甲醚
3.2 对照品溶液制备 精密称取大黄素12.9 mg,大黄素甲醚3.2mg,用适量甲醇超声溶解,再用甲醇定容至100mL,制成贮备液。取大黄素、大黄素甲醚对照品溶液混匀后进样,得对照品色谱图,如图2。
3.3 样品溶液制备 取样品研成细粉,混匀,精密称量约1g,用氯仿 40mL,水浴回流1h,滤过,残渣再分别用氯仿
(40mL、40mL、30mL)回流30min,合并滤液,挥干氯仿,得残渣,用甲醇定容至25mL,摇匀,作为样品溶液,进样分析,其色谱图见图2。以外标法计算组份含量。
按处方量称取虎杖药材适量,照上法制备溶液,进样,得色谱图见图2。
3.4 阴性对照液制备 按处方量称取不含虎杖药材的阴性样品,然后按样品溶液制备方法制备溶液,进样,见色谱图2。对测定无干扰。
A B C D 图 2 A-阴性样品 B-混合对照品 C-虎杖药材 D-样品
3.5 线性范围考察 精密吸取大黄素对照品溶液适量,配成浓度分别为28.7、43.0、51.6、64.5、86.0、129.0mg.ml-1的溶液,进样测定,记录峰面积,以峰面积(Y)对浓度(X)进行回归,得大黄素的线性方程为Y
=30518.0 X +35607.0 ,r=0.9999 (n = 6);精密吸取大黄素甲醚对照品溶液适量,配成浓度分别为9.2、11.5、15.3、18.4、23.0、30.7mg.ml-1的溶液,进样测定,记录峰面积,以峰面积(Y)对浓度(X)进行回归,得大黄素甲醚的线性方程为Y
= 31550.0X - 3063.1 ,r=0.9998 (n = 6)。
3.6 精密度试验 取大黄素,大黄素甲醚混合溶液,连续进样6次,得对照品峰面积,计算大黄素峰面积的RSD 为1.1%,大黄素甲醚峰面积的RSD为2.0%。
3. 7 稳定性试验 对批号为20000114样品溶液在0、0.5、1、2、3、5h分别进样,记录峰面积,结果6次进样,大黄素峰面积的RSD为1.6%,大黄素甲醚峰面积的RSD为2.0%,可见样品溶液较稳定。
3. 8 回收率测定 称取已知含量的同一批号样品5份,分别加入对照品贮备液适量,按样品制备方法制得溶液,进样,测得回收率,其结果见表1、2。
3. 9 样品测定 按上述方法,分别测定3批样品,结果见表3。 表1 大黄素回收率试验结果 |
称样量 /g |
相当大黄素量 /mg |
加入大黄素量 /mg |
测得量 /mg |
回收率 /% |
平均回收率/% |
RSD /% |
1.0167 |
1600.3 |
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2465.3 |
95.8 |
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1.0322 |
1624.7 |
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2519.0 |
99.0 |
|
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1.0201 |
1605.6 |
903.0 |
2514.4 |
100.6 |
98.7 |
2.5 |
1.0092 |
1588.5 |
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2503.9 |
101.4 |
|
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1.0062 |
1583.7 |
|
2455.6 |
96.6 |
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表2 大黄素甲醚回收率试验结果
称样量 /g |
相当大黄素量 /mg |
加入大黄素量 /mg |
测得量 /mg |
回收率 /% |
平均回收率/% |
RSD /% |
1.0167 |
290.7 |
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574.0 |
98.4 |
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1.0322 |
295.1 |
|
577.1 |
97.9 |
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1.0201 |
291.6 |
288.0 |
589.3 |
103.4 |
98.6 |
3.1 |
1.0092 |
288.5 |
|
572.6 |
98.6 |
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1.0062 |
287.7 |
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561.1 |
94.9 |
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表3 三批样品中大黄素、大黄素甲醚含量测定结果
批号
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大黄素 /mg.g-1
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大黄素甲醚 /mg.g-1
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20000217
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1740.2
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300.0
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20000331
|
1690.0
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304.1
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20000421
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1788.8
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321.2
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4. 讨论
4.1 从图1可知,乙醇回流法与氯仿回流法所得的峰面积较接近,但用乙醇提取所得样品杂质较多,影响测定,而且前者提取过程较繁锁,故选氯仿回流作为文中的提取方法。
4.2 按文献[5,6,7]比较了不同组成的流动相即不同配比的甲醇-水-高氯酸、甲醇-水-冰醋酸、甲醇-水-磷酸;结果表明以甲醇-水(333:156),用磷酸调pH至2.5的流动相所得的峰达到基线分离,且峰形很好,在13min内出完所有的峰;流动相pH控制尤为重要,若pH高于4,峰出现拖尾现象。经预试发现,若采用C18柱,大黄素与大黄素甲醚不能分离,且与杂质也分离不好,而采用C8柱,不但分离完全,峰也较尖锐。
参考文献 1. 苏子仁,曾惠芳,史俏蓉. 虎杖提取工艺初探. 中国实验剂学杂志,1998,4(1):9
2. 卫生部药典委员会编. 中国药典(一部). 广东化工出版社出版,1995:179
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