高效液相色谱柱后衍生化法测定饲料中盐霉素

中国农业大学动物医学院  &   中国农业科学院原子能研究所 

　　［摘要］对高效液相色谱柱后衍生化测定饲料中盐霉素的方法作验证研究。采用C18反相柱，甲醇—冰乙酸—水为流动相，香草醛为衍生剂。方法检测极限为0.5μg/ml，添加回收率为85.6%，变异系数为4.92%。
　　关键词　高效液相色谱柱后衍生化　盐霉素　　盐霉素(Salinomycin)是一种聚醚类单羧酸化合物，盐霉素钠盐作为一种饲料添加剂主要用于防治家禽球虫病，也用于改善肉鸡生产性能，其在饲料中的添加浓度为60mg/kg，当浓度超过100mg/kg时则对肉鸡生产性能产生不良影响。
　　最初对饲料中盐霉素的检测方法主要为比色法及生物测定法。80年代后发展了采用各种衍生剂的高效液相色谱法，其中高效液相色谱柱后衍生化法(HPLC—PCD)具有特异性强、灵敏度高、简便快速、便于自动化等优点。国外已有一些研究报道，国内这方面的研究工作刚刚开始，我们采用香草醛为衍生剂，进行了高效液相色谱柱后衍生化测定饲料中盐霉素的方法研究，取得了良好结果。
1　材料与方法
1.1　仪器和试剂　高效液相色谱仪(泵SP8810，紫外检测器SP8450，积分仪SP4270)，北分BFS—5106型柱后衍生化装置，盐霉素标样(美国Sigma公司)，甲醇(优级纯)，蒸馏水为全玻璃重蒸，香草醛等其余试剂为分析纯。
1.2　标准品和溶液的配制
　　流动相：甲醇—冰乙酸—水(940∶60∶1，v/v)；
　　香草醛衍生液：将20g香草醛溶于冷却的甲醇—硫酸(250+5，v+v)溶液中，避光，现用现配；
　　样品提取液：甲醇—水(90∶10，v∶v)
　　标准溶液：准确称取一定量的盐霉素标样，用甲醇配制成1000μg/ml的标准贮备液，用甲醇—水(90∶10，v/v)稀释成2.0、5.0、10.0、25.0μg/ml系列浓度的标准溶液。
1.3　饲料样本的提取　称取20g饲料样品于250ml具塞三角瓶中，加入100ml样品提取液，在往复震荡器上震荡45分钟，静止片刻，过滤上清液，取部分上清液用0.45μm滤膜过滤后进行HPLC—PCD测定。
　　样本添加回收率的测定设3个添加水平，浓度分别为30、60、120mg/kg，每个水平作3个重复，样本的前处理过程同上。
2　结果
2.1　色谱条件及保留时间
　　色谱柱：C18反相柱，250×4.6mm id，粒径5μm；
　　检测波长：520nm
　　流动相流速：0.8ml/min
　　衍生液流速：1.6ml/min
　　反应温度：95℃
　　反应管：0.2mm×10m
　　进样体积：200μl
　　盐霉素的保留时间：13.6分钟
2.2　标准曲线
　　在上述色谱条件下，测定标准溶液浓度系列的响应值，绘制标准曲线，其线性回归方程为Y＝-152.2+383.0X，相关系数为0.9992。
浓度(μg/g)
2.3　添加回收率
　　3个水平3个重复的添加回收率见附表。
附表　饲料中盐霉素添加回收率
　检测浓度 μg/g回收率 %变异系数 %
3024.581.7
3027.090.0
3026.588.3
平均值26.086.75.05
6048.080.0
6054.590.8
6052.587.5
平均值51.786.16.42
12098.081.7
120100.083.3
120104.587.1
平均值100.884.03.30
3　讨论
　　本文研究了使用高效液相色谱柱后衍生化系统测定饲料中盐霉素的方法，通过参考有关文献，进行了对流动相的组成、香草醛衍生液的浓度、流动相和衍生液的流速比例等测试条件的多次试验，选择了上述的最佳色谱条件。从表1可以看出：使用高效液相色谱柱后衍生化法测定饲料中盐霉素回收率较高，在30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg3个水平上的平均回收率分别为86.7%、86.1%和84.0%，而且在每个水平上的3个重复变异系数都较低，分别为5.05%、6.42%和3.30%。另外，从盐霉素标准曲线及回归方程还可看出，使用高效液相色谱柱后衍生化法测定饲料中盐霉素线性相关非常理想。
　　试验证明本方法操作简便易行，色谱条件易于掌握，测试数据重复性好，回收率较高，精密度和准确度都能满足分析要求，是测定饲料中盐霉素的可行方法。

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