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气相色谱法测定生物组织中
克仑特罗残留的研究
赵立峰 李颖
（杭州萧山区疾病预防控制中心 311201）
摘要：研究了气相色谱法测定生物组织中克仑特罗（Clenbuterol）残留的分析方法。试样中Clenbuterol用0.5mol/L盐酸提取，再用NaOH调碱后以氯仿萃取。萃取液经旋转蒸发浓缩，氮气吹干后以甲醇定容。最后用气相色谱法以HP1701毛细管柱分离，氮磷检测器测定。研究表明，Clenbuterol色谱峰分离良好，回收率在72%~84%之间，变异系数为2.6%~5.7%，最低检出浓度为0.01mg/kg。
关键词：克仑特罗 气相色谱 残留测定
1. 前言
克仑特罗俗称“瘦肉精”，是人工合成的β-肾上腺素能受体兴奋剂，我国已正式下文严禁作为饲料添加剂。但目前仍有不少非法使用的情况存在，严重危威胁着人们的健康。目前国内所报道的检测克仑特罗残留方法多为气相色谱-质谱联用法，液相色谱法[1]，而气相色谱法测定尚未有报道。本文用气相色谱法对测定生物组织中克仑特罗的残留进行了研究，建立了样品提取简单，色谱峰分离良好，灵敏度高的测定方法，取得了满意的结果。
2.实验部分
2.1.仪器与试剂
Agilent6890气相色谱仪，附氮磷检测器（NPD），HP6890化学工作站，旋转蒸发器，离心机，超声清洗器，组织捣碎机。
盐酸0.5mol/L
氢氧化钠400g/L
氯仿、甲醇、无水硫酸钠，均为分析纯。
盐酸克仑特罗标准，购于SIGMA公司，用甲醇配成100μg/ml的储备液。
2.2.样品处理
取切碎后生物组织样品约100g，放入组织捣碎机匀浆5min，取10.0~20.0g匀浆液，加入30ml盐酸，超声提取15min，并不时搅拌。后以4000转/min离心10min，取上清液倒入150ml分液漏斗；对下层沉积组织再重复提取一次。合并上清提取液，滴加氢氧化钠溶液调PH至12。加入15ml氯仿，轻轻振摇萃取，静止放置5min分层，放出下层氯仿，过置有30~40g无水硫酸钠的漏斗收集。并再分别以10ml的氯仿重复萃取两次，收集合并萃取液，后以20ml氯仿洗涤无水硫酸钠合并收集液。用旋转蒸发器于55℃水浴上蒸发至约1ml，氮气吹干。以甲醇定容至1.0ml即为试液，取1.0μl进行色谱分析。
2.3. 色谱条件
HP-1701石英毛细管柱（25m×0.20mm×0.20μm）；载气为高纯N2，柱压为140KPa，柱温为初温170℃，0.5min后以25℃/min上升至240℃保持7min，进样口270℃，不分流，吹扫时间0.5min，100ml/min；检测器温度290℃，尾吹气为8ml/min。
在上述条件下，盐酸克仑特罗峰型清晰，分离清晰，保留时间为6.86min，如图一：
2.4. 标准曲线
分别取适量的标准储备液，以甲醇稀释配成2.0、4.0、10.0、20.0μg/ml的标准工作液，进样1.0μl分析。并以峰面积对浓度绘制标准曲线，标准方程为： Y=43.5X+6.3，Y为峰面积，X为浓度（µg/ml），r=0.9998。
3.实验结果与讨论
3.1. 回收率与精密度试验
以保留时间定性，峰面积定量。分别取猪肝与猪瘦肉样品10.0g，分别添加1.00及0.50mg/kg水平浓度的标准，同一水平加标分别做四份测定，计算回收率与精度，结果如下表一：
|
|
添加水平mg/kg |
本底值mg/kg |
测定值mg/kg |
回收率% |
变异系数% | |||
|
1 |
2 |
3 |
4 | |||||
|
猪肝 |
0.50 |
<0.05 |
0.36 |
0.38 |
0.41 |
0.37 |
72~82 |
5.7 |
|
1.00 |
<0.05 |
0.79 |
0.75 |
0.77 |
0.73 |
73~79 |
3.4 | |
|
猪瘦肉 |
0.50 |
0.22 |
0.64 |
0.58 |
0.58 |
0.61 |
72~84 |
4.8 |
|
1.00 |
0.22 |
0.95 |
0.92 |
0.98 |
0.96 |
70~78 |
2.6 | |
表一：回收率与变异系数表
由表可得，在1.00及0.50mg/kg水平浓度加标测定，回收率在72%~84%之间，变异系数为2.6%~5.7%。可见加标回收及精密度较好。
3.2.样品提取与净化
3.2.1.样品的提取
样品液的提取是极为重要的实验环节。由于在酸性条件下，克仑特罗溶于水而几乎不溶于氯仿等有机溶剂，本文选择用盐酸超声两次提取，提取速度快而完全，效果良好。
若采用样品加100ml的盐酸超声提取20min后，直接过滤，由于盐酸提取液中含有大量的蛋白质与脂肪类物质，使提取液呈胶液状，很难过滤。
实验曾采用对样品加盐酸超声提取后，直接调碱再加乙酸锌沉淀蛋白质并过滤，滤液再以氯仿萃取，虽然有效解决了萃取中的乳化问题，但结果回收率均小于30%。可能为在碱性条件下沉淀的蛋白质类絮状物吸附了盐酸克仑特罗引起。
3.2.2. 萃取溶剂的选择
在碱性条件下，克仑特罗溶于有机溶剂而微溶于水。将提取液用氢氧化钠调碱后，有文献[2]报道了用乙酸乙酯作为萃取剂，但实验发现，乙酸乙酯振摇后乳化严重，有机层浮于提取液上，分离较为麻烦。再对氯仿、二氯甲烷两种有机萃取剂进行分析比较，发现二氯甲烷乳化也较为严重，沉淀分层困难。而氯仿相对比重高，容易沉淀，虽也会有轻微乳化现象产生，但只要不用力振摇萃取，沉淀分层较二氯甲烷理想，萃取效果较好。
3.2.3. 样品净化
在气质谱联用和液相色谱的不少分析方法中[3][4][5]，均提到了在色谱分析前，须过固相萃取柱或氧化铝柱净化，以排除干扰峰。本实验对盐酸提取液调碱后用氯仿萃取，旋转蒸发浓缩，氮气吹干，最后用甲醇溶解定容，直接进样分析。省去过柱步骤，得到色谱峰分离良好，峰形清晰，未发现有明显干扰现象。如图二、图三 。
3.4. 最低检出浓度
以3倍色谱基线噪音为最低检出限，若取样为10.0g，则本法最低检出浓度为0.01mg/kg。
由此可见本文所研究建立的方法，提取简便，色谱峰分离良好，回收率好，精密度高，最低检测限能满足生物组织样品残留检测的需要。
参考文献
1、 Jin Mi-cong. Clenbuterol and it’s determination method. Chinses journal of health laboratory technology. 2002, 12(4)：505-507
金米聪.克仑特罗及其检测方法.中国卫生检验杂志，2002，12（4）：506-507
2、 Wu Ping-gu . Determination of clenbuterol in biological samples by gas chromatography mass spectrometry. Jornal of instrumental analysis 2002, 21(1):19-21
吴平谷.生物材料中克仑特罗的气相色谱-质谱法测定.分析测试学报，2002, 21（1）：19-21
3、 Feng Jie , Wu Ping-gu. Determination of clenbuterol in feeds by gas chromatography-mass spectrometry. Acta zoonutrimenta sinica. 2000, 12(4): 47-50
冯杰，吴平谷.饲料中克仑特罗的气相-质谱联用法测定.动物营养学报，2000, 12（4）：47-50
4、 Leyssens L, Driessen C,Jacobs A. Determination of β2—receptor agonists in bovine urine and liver by gas chromatography mass spectrometry. Journal of Chromatography, 1991, 564(2): 515-527
5、 DB33/T307-2001. The analysis of clenbuterol in edible tissues
DB33/T307-2001. 可食性动物组织中盐酸克仑特罗残留量的测定方法
Study on Residue analysis of Clenbuterol in Biological
Zhao li-feng, Li ying（Antiepidemic and Sanitation Station of Xiaoshan Hangzhou 311201, China）
Abstract: The clenbuterol residues in biological samples was extracted by 0.5mol·L-1 hydrochloric acid. Then it was extracted by chlorform after adjusting to alkalinity with NaOH. The extractant was condensed by revolving evaporator and was blew to dry by N2. At last used methanol to set volume. Then it was analysed by gas chromatography method with HP1701 capillary column to separate and nitrogen-phosphorus detector (NPD) to detect. The experiment showed that the clenbuterol peak had been well separated and the recovery ratio of the method are 72%~84%, RSD are 2.6%~5.7, and the minimum detection limit was 0.05mg/kg.
Key words：clenbuterol； gas chromatography； residue analysis