色谱法测定三羟乙基芦丁的血药浓度

            摘要　目的:建立三羟乙基芦丁的血药浓度测定方法。
            方法：将三羟乙基芦丁转变成四羟乙基芦丁，经高效液相色谱分离后，用荧光检测器测定。
            结果：血药浓度标准曲线在1.25～40 ng.mL-1间，r=0.9994；最低检测限为1　ng.mL-1；高、中、低3种浓度平均回收率为91.52 %～95.83 %。日内和日间平均RSD小于4.3 %和5.2 %。

            结论：本法可为羟乙基芦丁的药动学研究提供一检测方法。
            羟乙基芦丁是一无毒黄酮类化合物，已成功地用于治疗和预防毛细血管的破损和膜渗透性增加等方面的疾病［1］。最近的研究发现它尚有捕捉基因的功能，这可解释其具有镇痛作用［2］。

            羟乙基芦丁是由一羟乙基芦丁至四羟乙基芦丁组成的混合物。其主要成分—三羟乙基芦丁［3,4,7－tri－(o－hydroxyethyl)－rutoside］占95 %左右，其紫外吸收性很弱，本身也无强荧光，加之口服后在血浆中浓度很低，故其血药浓度的测定较困难。本文探讨了用层析柱(XAD－2)将羟乙基芦丁从血浆中提出，再用2－氯乙醇将其中三羟乙基芦丁转化成具有强荧光的四羟乙基芦丁后，用反相高效液相色谱法分离，用荧光检测器进行测定的方法以满足药代动力学研究和临床监测的需要［3，4］。

            1　仪器及试药
            SP1000高效液相色谱仪，821－FP型荧光分光检测器，Spectra－physics积分仪。
            羟乙基芦丁对照品(Ursa－Chemie
            Gimbh，含量99.68%，为用紫外法测定的二、三、四羟乙基芦丁总量,其中三羟乙基芦丁为95%以上。)
            2－氯乙醇、1－氯－2－丙醇、氢氧化钠、磷酸、氯化铵为分析纯(AldrichChemical
            Company),乙腈、甲醇为色谱纯(Merck Darmstadt)，水为重蒸馏水。

            2　色谱条件
            色谱柱：ODS(250 mm×4.6 mm,7 μm)；流动相：乙睛－水(460∶2050)；流速：1.5 mL.min-1；荧光检测波长360 nm/470 nm。

            3　内标
            为寻求一个保留时间适宜又在相同激发波长下有较强荧光的物质作内标，经用1－氯－2－丙醇合成，在三羟乙基芦丁的5位羟基上接一分子异丙醇，经柱层析分离得3,4,7－3［o－羟乙基］5－［o－羟异丙基］－芦丁(3,4,7－tri［o－hydroxyethyl］5－［o－hydroxypropyl］－rutoside).该内标与样品能很好分离，分离时间达4 min。见图1。

            4　样品处理
            取血浆样品1 mL置提取柱(Serva XAD－2,1 cm×5 cm)上，负压下用水5 mL淋洗，再用甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液在40℃水浴中减压抽干，用10 %氢氧化钠溶液200 μL溶解残渣。分取该碱溶液100 μL于另一试管中，加入40 %磷酸溶液25 μL和内标溶液100 μL，混匀，作为空白对照液；在剩余的100 μL碱溶液中加入氯乙醇25 μL，密塞，在75  ℃下放置2h，然后加入20 %氯化铵溶液25 μL和内标溶液100 μL，混匀，作为供试品溶液；取上述2种溶液各20  μL注入液相色谱仪，按内标法计算供试品与空白对照分别与内标峰面积比之差值。

            图1　样品色谱图
            1.四羟乙基芦丁　2.内标
            5        标准曲线的绘制
            取空白血浆，加入羟乙基芦丁对照品制成每1 mL中含1.25、2.5、5、10、20、40 ng的浓度系列，照“样品处理”项下操作，以羟乙基芦丁浓度为X轴，样品液和空白对照液分别与内标物的峰面积比之差为Y轴，二者呈线性关系，回归方程为：
            Y=1.312+18.583X，r=0.9994

            6　回收率及精密度试验
            回收率：用空白血浆配制成每1 mL中含羟乙基芦丁5、20、40 ng的样品各5个，按“样品处理”操作测定；再分别取上述浓度的对照品溶液不经柱层析洗脱，而直接按“样品处理”项下，自“加入氯乙醇25 μL，密塞，在75 ℃下放置2 h”起操作，即经化学转化后进样，测定峰面积，计算3种浓度的平均回收率分别为91.52 %、92.84 %、95.83 %，RSD分别为4.9 %、5.7 %、2.4 %。
            精密度：用空白血浆加入羟乙基芦丁对照品制成5、20、40  ng.mL-1的样本，按“样品处理”操作测定。日内平均RSD为4.3%，日间RSD为5.2 %(n=9)

            7　健康人血药浓度测定
            由4名健康志愿者单剂量口服羟乙基芦丁片剂或溶液剂900 mg后，在0～12 h内每隔2 h静脉取血3 mL（前2 h适当密集），分离出血浆，按标准曲线项下操作测定，结果口服片剂后血液中芦丁浓度C极小，而口服溶液剂后，最高血浓几乎是片剂的4倍。服药后1～2 h达到顶峰。见图2。
            图2　口服托克芦丁900 mg后血浓曲线(n=4)
            1.片剂　　　2.溶液剂

            8　讨论
            8.1　本法是将羟乙基芦丁中的主成分三羟乙基芦丁转化成四羟乙基芦丁来进行测定，而羟乙基芦丁中原来存在的四羟乙基芦丁是一不定量，故每支样本均应测出原存在的四羟乙基芦丁的量作为空白值减去。空白对照液和供试品液最终的酸度和体积不一，故要进行酸度调整并加以等量的内标。

            8.2　经化学转化后生成的四羟乙基芦丁在碱性溶液中和过量的氯乙醇存在的条件下是稳定的，但碱性溶液直接进样对柱子有损害。在酸性溶液中，四羟乙基芦丁不稳定，会很快分解，经实验证明，pH在6.5～7之间合适，样品液在室温下放置48 h，测定值不变。

            8.3　经实验，化学转化率随反应温度的增加和反应时间的延长而增加。在70 ℃，2 h后，转化率可达90 %左右，再继续延长反应时间，转化率增高不明显，故采用70 ℃，2 h。由于转化率是一不定量，故在样品测定中，标准浓度系列应与被测样品在同等条件下进行化学转化。

            8.4　此化学转化反应并不专属，食物中所含黄酮类化合物也可有此反应。故受试人员的饮食除一般规定外，应在受试前48 h内不得食用水果、鲜果汁和巧克力。

            8.5　本实验仅有4名志愿人员进行了血浓测定预实验，口服片剂后血浓很低，口服溶液剂900 mg后,最大血药浓度也仅为12.5 ng.mL-1(见图2),国外某些用14C标记法测定口服300 mg后的最大血药浓度为200
DPM.mL-1［5］。是否由于羟乙基芦丁的代谢速度太快而无法在血液中测到它的原形尚值得探讨。