反相高效液相色谱法测定人血清中细辛脑浓度

摘要：目的：建立以反相高效液相色谱法测定人血清中细辛脑浓度的方法，以用于生物利用度研究：方法：采用Shimpack CLCODS(150mm×6.0mm，lOμm)为色谱柱，以甲醇-水(80：20)为流动相，流速为lml／min，荧光激发波长为265nm，发射波长为365nm，柱温为40℃ 。结果：细辛脑最低检出浓度为0.2ng／ml，线性范围为1～200ng／ml；日内RSD≤6.74％(n=3)，日间RSD≤4.95％(n=5)。结论：本方法简便、灵敏，测定结果准确，适用于细辛脑药动学和生物利用度的研究
关键词：反相高效液相色谱法；细辛脑；血药浓度
细辛脑是根据中药石菖蒲中主要有效成分a-细辛脑(2，4，5-三甲氧基-1-烯基苯，又名a-Asarone)，经人工合成的具有止咳平喘和抗癫痫作用的药物。由于该药进入人体后的血药浓度非常低，因此对其进行药动学和生物利用度研究存在一定困难，必须找到一种灵敏度高、专一性强的定量检测方法。本文中，笔者所建立的反相高效液相色谱荧光检测定量方法可满足细辛脑的药动学和生物利用度的研究要求。
l 实验方法
1．1 试剂与仪器
细辛脑对照品(桂林制药二厂提供，批号：981006)；细辛脑片剂1、细辛脑片剂2(均由湖北省药检专科学校研制，批号：20000301、20000405)；细辛脑注射液(桂林制药二厂，批号：981006)；甲醇(优级纯，北京化工厂)；其它试剂均为分析纯。LC-6A型高效液相色谱(HPLC)仪、RF 535型荧光检测器(日本Shimadzn)。
1．2 色谱条件
色谱柱：Shimpack CLC ODS(150mm×6.0mm．10μm)：保护柱：Shimpack G ODS(10mm×4.0mm，10μm)；流动相：甲醇-水(80：20)；流速：lml／min；柱温：40℃ ；荧光激发波长：265nm，发射波长：365nm。
1．3 血样处理
取血清0.2ml，加入2.5ml二氯甲烷，旋涡振荡2min，再以2O00g离心10min，下层液全部转移至另一尖底试管中，置于35℃水浴锅中，并用氮气挥干。残留物用50μl甲醇溶解后，取20μl进样。
1．4 标准曲线的制备
精密称取细辛脑对照品50mg，置于5Oml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度为lmg／ml的标准贮备液。临用前再以甲醇稀释成一定浓度的系列标准工作溶液，分别精密量取适量，加入0.2ml空白人血清中，配制成浓度为1、5、25、50、100、200ng／ml的标准血清，按照“1．3”项下方法进行处理。
1．5 计算
以外标法计算细辛脑含量。
2 结果
2．1 色谱行为
在“1．2”项色谱条件下，细辛脑峰形对称陡峭，无内源性物质峰干扰，保留时间为7.68min。
2．2 标准曲线与线性范围细辛脑浓度(Y)在1～200ng／ml范围内，与峰高(X)呈良好的线性关系，回归方程为Y =20.87X—7.98，r=0.9998。血清最低检出浓度为0.2ng／ml。
2．3 回收率与精密度试验
在标准曲线浓度范围内，选择2．5、10、40、75、150ng／ml 5种浓度进行方法回收率试验，每种浓度日内平行操作测定3次，日间平行操作测定5次。可知，其平均回收率为(101.18±1.77)％，RSD=1.75％。
3 应用
笔者应用本文建立的测定方法，对采用不同生产工艺的细辛脑片剂进行了生物利用度研究，即对18名健康志愿者单剂量交叉给予细辛脑片剂1(120mg)、细辛脑片剂2(120mg)和细辛脑注射剂(16mg)后测定受试者血清中的细辛脑浓度。经计算，细辛脑片剂1的绝对生物利用度为(5.4±1.6)％，细辛脑片剂2为(9.5±2.5)％。以细辛脑片剂1为参比制剂，细辛脑片剂2的相对生物利用度为(181.9±15.2)％。证明细辛脑片剂2(经生产工艺改造)生物利用度提高了81.9％。
4 讨论
细辛脑在258nm波长处有最大吸收，但其在人血中的浓度极低，只达到ng／ml级，采用紫外检测器达不到测定要求。本文中，笔者根据细辛脑化学结构的特点(含3个甲氧基和1个丙烯基的苯环)，选用荧光检测法，灵敏度大大提高，高于薄层色谱法和HPLC—UV法细辛脑被吸收后可迅速进入红细胞内，其在全血、血球及血浆中的浓度以血球中为最高” 。故分离血清时，应特别小心不能发生溶血情况。
细辛脑熔点低，在加温挥干二氯甲烷时，温度最好不超过35℃。另外，本法测定的浓度范围较宽，低浓度定量往往误差较大，因此操作时可将标准曲线分为两个浓度范围，以减少测定误差。
参考文献
[1]杨巷菁，赵真玲．气相色谱法测定血液中a-细辛醚的浓度[J]．中草药，1987，18(10)：442．