反相离子对色谱分离水溶性维生素

一、目的要求
    1.掌握反相离子对色谱分离水溶性纤维素的方法。
    2.了解反相离子对色谱分离水溶性纤维素的原理及方法特点。
二、基本原理
    水溶性纤维素包括：VB1 (硫胺素)，VB2(核黄素)，VB5(烟酰胺，烟酸)，VB6(吡哆醛、吡哆醇)，VB11（叶酸），VB12(钴维生素)和VC等。在用反相离子对色谱法测定中，阳离子A+(样品离子)和反离子B-(烷基磺酸根离子)先形成离于对，再在流动相和固定相中分配，
    保留时间为：
    tR=tM (1+ EA，B[B-]水相/β)式中，β为相比，tM为死时间，EA，B为平衡常数。
    可见样品的保留时间受离子对试剂的浓度和可逆过程的总平衡常数的影响。因此，对混合水溶性纤维素分离的影响,除反离子的浓度外，还有流动相的pH值，甲醇与水的配比，有机添加剂三乙胺(TEA)浓度和柱温。TEA作为流动相的添加剂，可减少碱性样品色谱峰的拖尾。
三、仪器与试剂
    1．仪器高效液相色谱仪；超声波发生器。
    2．试剂：甲醇；十二烷基磺酸钠；三乙胺；水溶性纤维素混合标样。
混合标样配制方法：
    将VB1、烟酸、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、VB12和VC溶于水配成含量均为30μg／m1的水溶液(溶液1)。将VB2和VB11滴入少量发5％Na0H使之溶解，再用去离子水稀释至各含100μg／m1的混合液(溶液2)。使用前，将溶液l和溶液2以1：1混合
，配成含9种纤维素的混合标样。以相应的方法制成各维生素的单个标样。
四、实验步骤
    1．实验条件：
    1) 色谱柱：YWG—G18，10μm，25cm×φ4.6mm；
    2) 流动相：甲醇：水=40：60，十二烷基磺酸钠1.5mmol/l，三乙胺0.3％，用磷酸调节PH至3.0；　
    3) 检测器：UV—254nm；
    4) 流动相流速：1.0mI／mln；
    5) 校温：30℃。
    2．启动仪器，用大约180m1流动相流经色谱拄，待基线稳定后，分别注入10μl的各单个维生素标样，记录色谱图和出峰时间。
    3．注入10μll混合试样，记录色谱图和各峰的出峰时间。
    4.实验结束，用90％甲醇一水溶液冲洗色谱拄1h左右。
五、数据处理
    根据标样的保留时间找出混合试样色谱图中各峰对应的样品名称。
六、问题讨论
    1.试述反相离子对色谱的分离机理。
    2.反相离子对色谱同时分离混合水溶性纤维素有哪些影响因素？
七、渣意事项
    1.制备流动相用试剂均为分析纯，水用二次蒸馏水，维生素为生物试剂。
    2.用庚烷盐作为离子对试剂效果更优，但其价格较贵。