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目的：建立高效液相色谱法测定人血浆中缬沙坦浓度。方法：采用高效液相色谱-荧光检测法，色谱柱为Phenomenex ODS(3)柱(25 0 mm×4.6 mm,5 μm)和Waters Guard-PAK保护柱，流动相为磷酸盐缓冲液(pH 2.8)-乙 腈(51.2∶48.8)，流速为1.4 mL*min-1，激发波长和检测波长分别为265 nm和37 8 nm。内标物为α-萘酚，采用蛋白沉淀过滤法处理血样。结果：本实验方法精密度及稳定性均良好，在13～2 076 ng*mL -1范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，r=0.999 6，方法回收率为93.6% ～103.6%，RSD≤3.6%(n=6)，日内、日间RSD＜5%。结论：本方法便捷、灵敏、准确、重现性好，可用于缬沙坦的人体 药代动力学研究。
关键词 缬沙坦 血药浓度 高效液相色谱法
缬沙坦(valsartan)，(S)-N-氧代戊基-N-｛［2-(1H-5-四氮唑基)联苯基- 4-］甲基｝缬氨酸，是一种口服有效的非多肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，直接作用于AT 1受体而发挥降压作用，是一类新型抗高血压药物。
目前国外有报道高效液相色谱法测定缬沙坦血浆浓度［1，2］，血样处理采用全自动 固相萃取装置。国内测定缬沙坦血浆浓度报道尚少见。本实验建立了一种高效液相色谱法测 定缬沙坦血浆浓度，在国外文献的基础上改进了血样预处理方法，重新选择了内标物，优化 了流动相的组成，具有预处理方法简便，回收率高，重复性好的优点，为人体药代动力学和 生物利用度研究提供了测定方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器 日本岛津LC-6A高效液相色谱仪，SCL-6A系统控制器，RF-551荧 光检测器，C-R4A色谱数据处理仪，7125手动进样阀；Orion 520A pH计，Sartorius电子分 析天平，50 μL微量进样器，Volac可调节加样器，TGL-16G台式高速离心机，Gelman 0. 45 μm针头式滤器。
1.2 试药 缬沙坦对照品，含量99.80%，北京东方绿原科技发展有限公 司提供；α-萘酚(内标)，分析纯，北京化工厂；缬沙坦胶囊，每粒80 mg，瑞士诺华公司。 乙腈，色谱纯，Fisher公司；磷酸二氢钾及磷酸(85%)，分析纯，北京红星化工厂；水为双 重蒸馏水，自制；甲醇，色谱纯，南开大学精细化学实验厂。
2 色谱条件
Phenomenex ODS(3)色谱分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Waters Guard-PAK保护柱；流 动 相：磷酸盐缓冲液(pH 2.8)-乙腈(51.2∶48.8)；流速：1.4 mL*min-1；激发波 长：265 nm，检测波长：378 nm。
3 实验方法
3.1 缬沙坦标准储备液的配制 精密称取缬沙坦对照品0.005 2 g置50 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得到104 μg*mL-1缬沙坦标准储备液。于4 ℃ 冰箱中存放备用。
3.2 内标储备液的配制 精密称取α-萘酚0.010 7 g置50 mL量瓶中 ，甲醇溶解并稀释至刻度，得到214 μg*mL-1内标储备液。于4 ℃冰箱中存放备用 。
3.3 磷酸盐缓冲液的配制 取磷酸二氢钾0.68 g溶于1 L水中，用磷 酸调节pH至2.8。
3.4 血浆样品的制备 精密吸取内标储备液5 μL置于1.5 mL聚丙烯 具塞离心管中，精密加入缬沙坦标准溶液适量，室温下氮气吹干。加空白血浆200 μL，涡 旋30 min后，加入乙腈200 μL沉淀蛋白，涡旋30 s，8 000 r*min-1条件下离 心5 min，吸取上清液，0.45 μm针头式滤器过滤，取滤液30 μL进样。
4 结果
4.1 色谱与分离 如图1所示，血浆中样品与内标能很好分离，血浆杂 质峰不干扰测定。
图1 色谱图
A.空白血浆 B.缬沙坦标准血浆 C.志愿者服药后血浆
1. α-萘酚 2.缬沙坦
4.2 标准曲线的制备 缬沙坦标准储备液用甲醇逐级稀释成20 758， 10 379，5 190，2 595，519，260，130 ng*mL-1标准溶液，分别取20 μL，按 “血浆样品的制备”项下操作，记录峰面积。以对照品峰面积与内标峰面积的比值(Y)对 对照品浓度(X)进行线性回归，得回归方程：
Y=0.018 1X-0.249 5 r=0.999 6
线性范围：13～2 076 ng*mL-1，最低检测浓度为13 ng*mL-1。
4.3 回收率及精密度试验
4.3.1 提取回收率 分别取高(20 758 ng*mL-1)、中(5 1 90 ng*mL-1)、低(260 ng*mL-1)缬沙坦标准溶液20 μL置具塞离心管中 ，加入内标储备液5 μL，室温下氮气吹干。加入乙腈400 μL，其余按“血浆样品的制备” 项下操作。比较高、中、低3个浓度经提取过程和相应浓度的标准溶液的峰面积，可得各浓 度绝对提取回收率(n=3)分别为97.45%，97.28%，95.61%；RSD分别为1.5%，1 .6%，4.8%。
4.3.2 方法回收率及精密度 分别取高(20 758 ng*mL-1) 、中(5 190 ng*mL-1)、低(260 ng*mL-1)浓度缬沙坦标准溶液18.0，25 .0，30.0 μL置3支具塞离心管中，分别加入内标储备液后，依法测定回收率，得到高、 中、低3个浓度的方法回收率±RSD(n=6)分别为(93.6±0.9)%，(96.9±2.9)%，(10 3.6±3.6)%；日内RSD(n=6)分别为0.92%，3.0%，3.5%；对高、中、低3个浓度连 续12 d进行测定，得到高、中、低3个浓度的日间RSD(n=12)分别为2.9%，3.5%，4.8 %。
5 应用
将本方法应用于20名健康受试者，单剂量口服80 mg缬沙坦胶囊，血浆药物浓度最低值(服药 后24 h)为(77.71±27.84)ng*mL-1，是最低检测限的4倍，证实本实验方法适用 于缬沙坦人体药物动力学和生物利用度研究。20名志愿者单剂量口服缬沙坦胶囊后平均药物 浓度-时间曲线见图2。
图2 20名志愿者单剂量口服缬沙 坦胶囊后
缬沙坦平均药物浓度-时间曲线图
6 讨论
6.1 文献［1］中血浆的预处理采用全自动固相萃取装置。我们尝试使用 了蛋白沉淀过滤法处理血浆样品，因缬沙坦极性较小，我们选用乙腈作为沉淀剂。本方法成 本低，操作简便，重复性好，回收率高。
6.2 文献［1］中内标为实验单位自行研制合成的化合物CGP 48 791，我 们从大量化合物中筛选出α-萘酚作内标，实验条件下与样品色谱性质相似，可基线分离， 且性质稳定，满足实验要求。
6.3 本实验对文献［1］中的流动相做了调整，改变了流动相比例，降低 了离子浓度，排除血浆杂质干扰，使样品与内标很好分离。
李晔（北京天坛医院药剂科 北京 100050）
赵志刚（北京天坛医院药剂科 北京 100050）
陈旭（北京天坛医院药剂科 北京 100050）
王景田（北京天坛医院药剂科 北京 100050）
郭健(卫生部临床检验中心特检室 100730）
肖飞(卫生部临床检验中心特检室 100730）
参考文献［略］