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目的：建立测定人血浆中水飞蓟宾浓度的反相高效液相色谱 法。方法：血样在pH 8.5条件下经乙醚提取后，采用μBondapak C18(3 00 mm×4.6 mm)色谱柱，甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(pH 3.0)(29∶20∶51)为流动相，以萘 酚为内标，检测波长288 nm。结果：水飞蓟宾在3.695～236.5 ng.mL-1范围内线性相关(r= 0.999 8)，方法回收率为96.5%，日内、日间RSD均小于2.3%(n=3)。结论：方法简便快速、灵敏度高，适用于该药的临床药理研究。
关键词 反相高效液相色谱法 水飞蓟宾 治疗药物监测
水飞蓟宾(silybin)是从菊科植物水飞蓟(Silybum marianus)果实中提取分离而 得到的一种黄酮类化合物，经药理、毒理研究，具有明显的保护及稳定肝细胞膜作用，对各 种毒物引起的肝脏损害有不同程度的保护和治疗作用。临床上主要用于急慢性肝炎的治疗 ［1，2］。
国外有报道采用高效液相色谱法测定体内水飞蓟宾的浓度［3～5］，但其预处理复杂 、分析时间长，或者采用正相色谱。本文建立了以萘酚为内标测定血浆中水飞蓟宾的反相高 效液相色谱法，方法简便、快速、准确，为水飞蓟宾的临床研究提供了一个简便灵敏的检测 手段。
1 仪器、试药
Waters高效液相色谱仪系列(包括：510泵、486紫外检测器，美国Waters公司)；NEC powerm at e 433电子计算机；Sartorius十万分之一天平(德国)；水飞蓟宾对照品(中国药品生物制品 检定所)；萘酚(内标，分析纯，含量99%)；水飞蓟宾胶囊(上海宝龙药业有限公司，规格： 每粒19.25 mg，批号981201)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯 。
2 溶液配制
2.1 水飞蓟宾对照品溶液 精密称取水飞蓟宾对照品7.39 mg ，加甲醇 溶解，定容于50 mL容量瓶中，取此溶液1.0 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得浓 度为1.478 μg.mL-1的对照品溶液。
2.2 内标溶液 精密称取萘酚9.80 mg，加甲醇溶解，定容于100 mL 容量 瓶中，取此溶液1.0 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得浓度为3.92 μg.mL- 1的内标溶液。
3 色谱条件
色谱柱：μBondapak C18柱(300 mm×4.6 mm，Waters)；预柱：μBondapak C 18柱(Waters)：流动相：甲醇-乙腈-25 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH 3.0)(29∶20 ∶51)；流速：1 mL.min-1；检测波长：288 nm；温度：40 ℃；进样量：20 μL。
4 生物样品处理
精取血浆样品1.0 mL，加内标溶液50 μL，0.1 mol.L-1磷酸氢二钠溶液0.2 mL ，加乙醚5 mL。旋涡振荡20 min, 3 000 r.min-1离心10 min，取乙醚液，在45 ℃下用N2吹干。残留物加流动相100 μL，旋涡振荡5 min，3 000 r.min-1 离心5 min，取上清液20 μL进样。
5 血浆标准曲线
精取空白血浆(健康人血，加肝素抗凝，离心分离血浆)1.0 mL 7管，分别加入水飞蓟宾对 照品溶液，使其浓度分别为3.695，7.39 0，14.78，29.56，59.12，118.2和236.5 ng.mL-1，按样品处理方法处理后进 样 ，以水飞蓟宾浓度(C)对水飞蓟宾与内标的峰面积比(A)进行线性回归，得回归方程 ：
C=92.08A-0.394 4 r=0.999 8
水飞蓟宾在3.695～236.5 ng.mL-1范围内线性相关。
在本文色谱条件下，血中杂质对样品均无干扰，水飞蓟宾及内标的保留时间分别为6.2和8 .5 min(图1)。
图1 血浆中水飞蓟宾测定的HPLC图
A.空白血浆 B.水飞蓟宾对照品+内标
C.空白血浆+水飞蓟宾对照品+内标 D.服药后1.5 h血浆样品
1.水飞蓟宾 2.内标
6 回收率试验
在空白血浆中精密加入水飞蓟宾对照品溶液，使其浓度分别为7.390，29.56，118.2 ng .mL-1，按样品处理方法处理后进样，计算回收率。结果平均回收率(n=3)分别 为97.0%，95.9%，96.7%；RSD分别为2.2%，1.1%，1.3%。
7 方法精密度
在空白血浆中精密加入水飞蓟宾对照品溶液，使其浓度分别为29.56，59.12，118.2 ng .mL-1，按样品处理方法处理后，进行日内、日间精密度测定，结果(n=3)日内 RSD分别为2.2%，0.58%，1.2%；日间RSD分别为2.3%，0.96%，1.1%。
8 应用
11名健康受试者口服4粒水飞蓟宾胶囊后，分别于不同时间取血，测定血药浓度。血药浓度 -时间数据经3p87实用药代动力学计算程序处理，结果表明水飞蓟宾的体内过程呈二室模型 ，其药代动力学参数分别为吸收速率常数0.76 h-1，分布相速率常数为1.21 h -1，消除相速率常数为0.48 h-1，药时曲线下面积为239.4 ng.h.mL-1 ，分布体积为0.40 mg.mL.ng-1，清除率为0.36 mg.mL.ng-1.h-1 。平均血药浓度-时间曲线见图2。
9 讨论
9.1 血浆样品预处理条件的选择 从血浆中提取水飞蓟宾时，单用乙醚无 法将水飞蓟宾提取出来。其结构存在酚羟基，其pKa=9.5左右，加入磷酸氢二钠溶液使pH=8.5左右时，由于脂溶性，才能将水飞蓟宾提取出来，而此时有机酸不被 提取出来，因而干扰少。乙醚萃取过程中，旋涡振荡时间对提取率也有影响。
图2 11名健康志愿者口服水飞蓟宾胶囊后
的血药浓度-时间曲线
9.2 色谱条件的选择 水飞蓟宾植物水飞蓟果实中除主要有效成分水飞蓟 宾外，还存在水飞 蓟宁(silydianin)、水飞蓟亭(silychristin)。而水飞蓟宾存在一对非对映体，经多次实验 发现，采用甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(pH 3.0)(29∶20∶51)为流动相，分离结果比较满意 。
9.3 内标的选择 采用内标可以减少测定误差，提高分析的准确度。经筛 选确定萘酚为内标，其对样品峰无干扰，出峰时间恰当。
缪海均（上海长征医院临床药理室 上海 200003）
李志远（第二军医大学药学院95级本科实习生）
刘皋林（上海长征医院临床药理室 上海 200003）