重组人粒细胞集落刺激因子的高效液相色谱分析

　　重组人粒细胞集落刺激因子(rhG -CSF)是应用DNA重组技术生产的一种造血生长因子，它作用于骨髓中性粒细胞系造血前体 细胞，促进其增殖、分化，促进中性粒细胞的成熟和释放。临床上主要应用于肿瘤化疗引起 的中性粒细胞减少症，用于外周干细胞动员，与抗生素合用预防或治疗感染等。
　　rhG-CSF 作为基因工程药物，在分离纯化过程中，蛋白质的定量测定对纯化的进行必不可少，同时在 产品的质量控制中，蛋白质浓度也是一个极重要的指标^［1］。蛋白质浓度的测定有 多种方法，常用的方法有克氏定氮法、TCA比浊法、双缩脲法、福林-酚(Lowry)法、考马斯 亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法等等。但以上方法有种种局限性^［2］，例如克氏 定氮法方法过于繁琐，双缩脲法不够灵敏，有近200种化合物影响Lowry法测定的结果,Bradf ord法在比色过程中易出现沉淀等等，因此以上方法均不适用于纯化过程中间体及成品中有 干扰物存在时rhG-CSF蛋白的定量分析。我们通过实验选择反相高效液相色谱法(RP-HPLC 法)作为测定有干扰因素存在时的蛋白定量，获得满意结果。
　　同时rhG-CSF其分子量大小 以及纯度均是一个重要指标。蛋白质分子量大小的测定有多种方法，常用的有十二烷基硫酸 钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法，聚丙烯酰胺梯度电泳，高效体积排阻色谱法(SEC 法)^［3］,比较先进的方法有质谱法^［4］。SDS-PAGE法耗时长，且一块板上 最多同时可分析8个样品。质谱法需要昂贵的设备，不易普及。而高效体积排阻色谱法是根 据溶质分子大小而分离的一种液相色谱技术，大分子优于小分子被洗脱出来，根据已知分子 量的标准蛋白的洗脱体积可以建立测定蛋白质分子量的标准曲线，从标准曲线上计算出样品 分子量。方法简便、快捷，一次可分析多个样品。我们通过实验选择高效体积排阻色谱法测 定rhG-CSF分子量及纯度，获得满意结果。

1　材料和仪器

1.1　仪器
　　Beckman公司高效液相色谱仪，包括125型泵，168型二极管阵列紫外检 测器,System Gold数据处理软件。色谱柱为Bio-sil 250(7.8mm×300mm,Bio-Rad公司),Vy dac C₄(150mm×4.6mm)。
1.2　试剂
　　三氟醋酸(Merck公司)；乙腈(上海脑海生物科技公司，HPLC 级)；DC Protein Assay Kit(Bio-Rad公司)；磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氯化钠均为国产 分析纯；牛血清白蛋白(Bio-Rad公司)；分子量标准品(Bio-Rad公司)。
1.2　样品
　　来自杭州九源基因工程有限公司。

2　方法和结果

2.1　rhG-CSF蛋白浓度测定
2.1.1　RP-HPLC分析条件　考察了色谱柱的种类、流动相的配比、流速、分析时 间等等条件，最后确定分析条件如下：色谱柱为Vydac C₄(150mm×4.6mm),流动相A为0.1% 三氟醋酸(w/v),流动相B为乙腈-水(90∶10),内含0.1%三氟醋酸(w/v),流速为1.0ml/min,检 测波长为215nm,梯度洗脱程序见表1。

表1　梯度洗脱程序

2.1.2　Lowry法分析条件　按照Bio-Rad公司提供的“DC Pr otein Assay Instruction Manual”操作，每个样品做3个重复。
2.1.3　对照品的制备　九源公司生产的rhG-CSF选择RP-HPLC纯度，凝 胶过滤色谱纯度，毛细管电泳纯度,SDS-PAGE纯度均大于99.9%的一批，以Lowry法重复测定 3次，计算平均浓度，再用20%甘露醇,10mmol/L的醋酸缓冲液精确稀释调整为:1mg/ml rhG- CSF,5%甘露醇,10mmol/L醋酸缓冲液，即为蛋白浓度测定的对照品。

2.1.4　RP-HPLC法标准曲线制备　分别吸取对照品10,20,25,30和35μl 进样，记录峰面积，以峰面积(Y)对蛋白量(μg)(X)作标准曲线，得回 归方程:Y=3.7423+20.5237X,r=0.9994。蛋白浓度的计算公式如下：

2.1.5　回收率实验　在对照品中加入1mg/ml的牛血清白蛋白，精确 吸取上述对照品15和22μl进样，按RP-HPLC法分析条件重复进样3次，记录rhG-CSF峰面积 ，按上述回归方程计算rhG-CSF蛋白浓度，由此算出平均回收率为100.17%,RSD=0.8%。
2.1.6　精密度实验　rhG-CSF中间体按RP-HPLC法分析条件 同一天内重复测定3次，计算日内RSD为0.7%,连续5d重复测定，计算日间[ WTBX]RSD为1.1%。
2.1.7　RP-HPLC法蛋白浓度测定与Lowry法蛋 白浓度测定结果比较　8批rhG-CSF原料药样品分别用RP-HPLC法及Lowry法测定蛋白浓度( μg/μl),结果见表2。

表2　2种蛋白浓度测定方法 结果

经t检验2种测定方法得到的蛋白浓度无显著差异(P＞0.05)。
2.2　分子量测定
2.2.1　色谱条件的选择　考察了缓冲液种类、离子强 度、pH值等因素，最终选定的色谱条件为：色谱柱采用Bio-sil 250(7.8mm×300mm),流动 相为0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8),0.15mol/L氯化钠，流速为1.0ml/min,检测波长为2 80nm。
2.2.2　标准曲线制备　选择分子量范围在15.8KDa-1.7KDa 的牛γ-球蛋白，牛血清白蛋白，鸡卵清蛋白，马肌红蛋白等标准蛋白制作标准曲线，以甲 状腺球蛋白的洗脱体积作为外水体积(V0),维生素B12的洗脱体积作为内水体积(V i),计算各标准蛋白的分配系数(Kd)。

以标准蛋白分子量的对 数对K_d作直线回归，回归方程为lgMW=5.981-4.5773K_d,r=0.9994,线性良 好。
2.2.3　样品测定　6批rhG-CSF原料药在上述色谱条件下分析 ，根据标准曲线和各样品的洗脱体积，计算分子量，结果见表3。测得样品平均分子量为185 00%±5%道尔顿，与理论值相一致，且与SDS-PAGE法测得分子量无显著差异。

表3　样品分子量数据

2.2.4　方法重现性　原料药1在同一天内重复测定3次， 计算日内RSD为0.7%。原料药1连续3d内重复测定，计算日间RSD 为1.9%，重现性好。

2.3　纯度测定
2.3.1　RP-HPLC法纯度测定　RP -HPLC法是基于溶质、极性流动相和固定相表面非极性基团之间疏水相互作用建立的一种色 谱分离模式。不同蛋白质其表面疏水基团数量、种类及分布不同，因而与固定相表面的非极 性基团之间的疏水相互作用就会不同，从而实现分离。在上述色谱条件下，分析rhG-CSF复 性液及疏水柱收集峰，按疏水性的均一程度证明其纯度。复性液样品中目标峰峰面积占总积 分面积的79.602%,因此纯度为79.602%,疏水收集峰中目标峰峰面积占总积分面积的86.804%, 因此纯度为86.804%(见图1)。

图1　rhG-CSF RP-HPLC法纯度测定图谱
A-复性液；B-疏水收集峰

2.3.2　SEC法纯度测定　rhG-CSF纯化中间体样C、D、E在上述色谱条件 下分析，记录出峰时间、峰面积，以标准曲线计算分子量，并以面积归一化法计算相对百分 含量作为rhG-CSF纯度的大小，结果见表4，图2。
　　由表4及图2可见,rhG-CSF纯化中间体样品成分较复杂，存在聚体及小分子杂质。而由表3可 见,rhG-CSF原料药纯度均大于98%,样品中只存在微量小分子杂质。

3　讨　论

　　rhG-CSF在纯化过程中带入的尿素、β-巯基乙醇等试剂,rhG-CSF制剂中加入的甘露醇,tween-80等赋形剂等均会对Low ry法蛋浓度测定的结果产生偏差，无法作为复性过程，纯化过程及制剂的蛋白质定量，而RP -HPLC法灵敏度高，重现性好，样品不需处理，同时可做rhG-CSF的蛋白纯度分析。以外标 法制作标准曲线，通过与样品在相同条件下层析比较，计算蛋白浓度，作为纯化过程及制剂 的定量方法。

表4　rhG-CSF纯化中间体分子量、相对百分含量

图2　rhG-CSF纯化中间体SEC图

　　高效体积排阻色谱法的分离机理是分子筛效应，通过分子量的计算能分离样 品中的单体和寡聚体，因此本方法也可作为rhG-CSF纯度测定的方法。方法简便、快捷，一 次可同时分析多个样品，重现性好。

钟英（杭州 310018 杭州九源基因工程有限公司）

参考文献

1，卫生部.关于转发人用重组DNA制品等质量控制要点的通 知.卫药政字(90)第37号.
2，胡卓逸，孙承琦.蛋 白质定量方法的进展.生物化学与生物物理进展，1990，17(1)∶23.
3，Martin Czok,Anitam Katti,Georges Guiochon.Effect of sample viscosity in high-performance size-exclusion chromatography and its control.J Chromatogr,1991,550∶705.
4，Michael J Geisow.Mass measurement at high molecul ar weight-new tools for biotechnologists.Tibtech December,1992,10∶432.