离子色谱法测定尿草酸的研究

    【摘要】 目的建立一种直接测定尿草酸的方法—— 离子色谱法，评价此方法在实验室和临床研究中的价值。方法搜集24h尿液用浓盐酸酸化保存，取0.1ml尿液，用0.3 mmol／L的硼酸溶液稀释，通过0.2μm的微孔滤膜过滤而注入离子色谱仪，检测出尿草酸浓度。结果对尿草酸的最小检测限为0.25μmol／L。批内变异系数CV=3.8％，日间CV=4.2％。尿样回收率96.5％～105.2％，CV=3.1％，此法与比色法显著相关(r=0.996，P<0.05)。结论此方法简单、准确而快速，适于实验室及临床尿草酸分析。
    【关键词】尿； 草酸； 色谱
    我们通过本研究建立了离子色谱法的技术、分析条件，并利用DX-80离子色谱仪成功进行了尿草酸的测定。
    材料和方法
    1．仪器：离子色谱仪DX-80(美国戴安公司生产)系统的主要组成有泵，泵为单柱塞往复泵，保护柱AG14A(Dionex P／N 056900，0.010一in ID PEEK)分离柱AS14A(Dionex P／N 056902)，抑制器AMMSⅢ(Dionex P／N056750)。操作方式：PeakNet IA软件通过DX LAN操作，数据通过Chromeleon软件处理。
    2．试剂准备：淋洗液：用分析天平分别称取1.696g的Na2CO3和0.168g的NaHCO3晶体，加去离子水至2L，配制成溶液浓度为0.008mol／L Na2CO3／0.001mol／L NaHCO3；再生液：取4ml浓H2SO4加去离子水至配制成溶液浓度为0.036mo1／L。取二水草酸晶体(H2S04·2H2O)0.126g加去离子水100ml配制成浓度为10 mmol／L的标准储备液，可4℃环境保存1周，再配制0.5 mmol／L的工作液。
    3．尿样准备：搜集24h尿液于聚乙烯瓶中，以100：1(尿液：浓盐酸)的比例加入浓盐酸使尿液酸化，使其pH<1.0。若要保留一段时间，则取其中少量置于密封聚乙烯瓶或玻璃瓶中于4℃保存。分析前，可将尿样静置至室温，然后取0.1 ml尿液。用0.3mmol／L的硼酸溶液以100：1(硼酸溶液：尿液)的比例稀释，通过0.2μm的微孔滤膜过滤以清除可能阻塞离子交换柱的任何物质。稀释后尿样的pH值约为2～3。
    4．色谱条件及工作流路：操作环境温度10℃～35℃，载气是氮气，压力为0.55～0.83 MPa(80～ 120psi)，泵的操作压力为低于21MPa(3000 psi)，开机后，其压力引保持在(2000±300)psi，背景电导小于30μS，流速0.5 ml／min。淋洗液从加压储罐流出，由泵输送至压力传感器、阻尼器、进样阀。样品注入定量环后，进样阀切换至Inject位置，淋洗液与样品混合后进入分析柱、抑制器、电导池，最后流入再生液储罐。在阴离子分析中，淋洗液的密度比再生液小，再生液从储罐底部压出送至抑制器，这是一种置换式化学再生(DCR)的运行方式。
    结 果
    1．草酸标准曲线绘制：取1mmol／L的工作液，用去离子水分别稀释至1.0、10.0、20.0、100.0μmol／L，分别注入离子色谱仪进样孔，在14.118min出现草酸峰。通过Chromeleon软件进行数据处理，自动绘制出标准曲线，在1～100μmol／L范围内，线性关系良好，r=0.999991，偏移值即截距为-0.0105，斜率为0.0339，回归直线方程Y=0.0339X一0.0105。检测限为0.25μmol／L。同时我们也取工作液，分别稀释至0.5、1.0,2.5、10.0μmol／L，发现其在0～10μmol／L的范围内也有良好的线性关系。
    2．重复性试验：1份尿样测得其浓度为4.1832mol／L，在1d内平行测定20次，得批内均数=4.1813μmol／L，标准差s=0.158 3 mol／L，变异系数CV=3.8％。尿样经4℃ 保存，每天测1次，连续测14 d，得日间=4.2281μmol／L，s=0.1797mol／L，CV=4.2％ 。
    3．回收试验：取一正常尿样，稀释100倍测得浓度为2.3218μmol／L，取该尿样3份均10ml，分别加入0.5 mmol／L的草酸工作液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml。测得草酸浓度并换算成测得量分别为0.0758、0.1265、0.167 0、0.2228、0.2700、0.3255μmol，计算回收率分别为105.2％、103.3％、95.5％、99.8％、98.7％、100.0％，其平均回收率为(100.6±3.2)％，变异系数为3.1％。同样，我们将尿样分别稀释50倍和20倍，测定并计算的回收率与之相似。
    4．相关性试验：分别用本法(Y)与比色法(x)测定35份随机尿样，作相关试验，回归直线方程为Y=0.993X-0.027，r=0.996，P<0.05，两者密切相关。
    讨 论
    我们采用DX-80离子色谱仪，其应用先进的AS14A分离柱以及抑制器AMMSⅢ，只需10μl的进样体积就能检测到浓度仅0.25μmol／L的尿草酸，此法所具有的低检测限以及大的线性范围等特点明显优于非抑制型电导离子色谱法。我们采用标准草酸液制订标准曲线时，其在1～100μmol／L的浓度范围内，线性关系良好，相关系数为0.999 91，检测限为0.25μmol／L。进一步测定，其在0～10μmol／L的范围内也有良好的线性关系。这些说明该方法对尿草酸测定的准确性及低检测限。进行重复性试验时，计算出的批内CV(3.8％)和日间CV(4.2％)均较小，说明该法对尿草酸检测的稳定性好。回收性试验时，其CV低于过去的其他离子色谱法，且与比色法相关性良好，进一步说明其对尿草酸测定的敏感性、稳定性及准确性。尿样用浓盐酸酸化首先可抑制尿中草酸盐沉淀，其次可抑制尿中VitC在中性或碱性条件下向草酸转化，同时有利于尿样保存的稳定性。尿样采用硼酸稀释100倍，且进样时用0.2μm可除有机物滤膜既可保持草酸的离子化状态，又可保护分离柱，而且草酸峰不受硼酸峰的干扰。在尿样检测中，会出现硫酸峰干扰草酸峰的问题，这必将会干扰草酸峰面积的准确评估，从而影响草酸浓度检测的准确性。我们通过降低淋洗液的浓度或者流速即很好地解决了这一问题。对于少数含有某种未知成份的尿样，该杂质峰与草酸峰非常接近，使草酸测定结果失实，采用草酸钙沉淀尿样预处理法，成功地消除了该成份的影响，使草酸的测定结果更准确。离子色谱法通过简单的尿样预处理能快速准确地测定尿草酸的浓度，为草酸钙结石的病因研究建立了较好的方法。
参考文献
1 Pfeiffer K，Berg W，Bongartz D，et a1．The direct determirmtion of urinary oxalate by non-suppressed ion chromatography．Eur J Clin Chem Chin Biochem，1997．35：305—308．