紫苏叶的质量研究-Ⅰ.气相色谱法测定紫苏叶中紫苏醛的含量

目的：建立紫苏叶中紫苏醛的含量测定方法。方法：以正十四烷为内标物，用气相色谱法，DB-5石英毛细管柱，柱温：135 ℃，FID检测器，测定紫苏叶中紫苏醛的含量。结果：紫苏醛的含量与紫苏叶性状有关，即色紫、气香的紫苏叶中紫苏醛含量较高。测定方法回收率为96.85%，RSD=3.2%(n=5)。结论：紫苏醛可以作为紫苏叶的质量控制指标之一，建立的方法简便、准确、重现性好。
关键词　紫苏叶　紫苏醛　内标法　气相色谱法

紫苏叶是常用中药，为唇形科植物紫苏Perilla frutescens(L.)Britt. var. arguta(Benth.)Hand.-Mazz.的干燥叶或带嫩枝，具有解表散寒，理气和胃功效，主要用于治疗风寒感冒，恶寒发热，咳嗽呕恶，胸腹胀满，慢性气管炎等。紫苏叶主要含有挥发油、花青素、黄酮及其苷、类脂类和多糖等化学成分。挥发油是紫苏叶的有效成分之一，国内外学者通过气-质联用方法，鉴定了挥发油中近百种化合物，其中紫苏醛约占50%，是紫苏油的主要成分^［1］。目前紫苏醛的含量测定方法仅见气相色谱法^［2］和盐酸羟胺滴定法^［3］，为提高方法重现性，作者采用内标气相色谱法，测定了全国21个道地紫苏叶样品中紫苏醛的含量，方法简便、准确、重现性好。
1　材料与方法
　　SC-7气相色谱仪（四川分析仪器厂），CDMC型色谱数据处理机(上海市计算技术研究所)。试剂均为分析纯，石油醚(60 ℃～90 ℃)。紫苏叶样品分别由各省市当地专业人员采集或购买,由朱兆仪研究员鉴定。
2　色谱条件
　　色谱柱：DB-5石英毛细管柱（0.25 mm×30 m，膜0.25 μm），柱温：135 ℃；气化室：250 ℃；离子室：230 ℃；气体流量:N₂ 25 mL^.min^-1、H₂ 19　mL^.min^-1、空气 180 mL^.min^-1，分流 107 mL^.min^-1，尾吹 62 mL^.min^-1；检测器：FID。记录纸速：0.5 cm^.min^-1。紫苏醛保留时间为5.90 min,内标物保留时间为7.82min。
3　紫苏醛对照品的制备
　　取阴干的紫苏叶，粉碎，采用水蒸气蒸馏法得到挥发油。经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯系统洗脱得到紫苏醛，其MS图谱与紫苏醛标准图谱一致。TLC（点样0.1 mg）及 GC（进样20 μg）分析均为1个点（峰），经GC归一化法测定，含量为99.76%；同时测得日本东京化成出品的紫苏醛含量为98.53%（标示含量不低于90%)。
4　方法学考察
4.1　内标物的选择　分别将β-伞花烃、芳樟醇、正十二烷、正十四烷和紫苏油制成乙酸乙酯溶液，进行GC测定。结果正十四烷峰不与紫苏油中其它峰重叠，并与紫苏醛完全分离，见图1。

图1　气相色谱图
A.对照品　B.紫苏叶
1.紫苏醛　2.内标物

4.2　标准曲线的制备
4.2.1　标准溶液的制备　精密称取紫苏醛对照品10 mg,加乙酸乙酯溶解并制成10 mg^.mL^-1的标准溶液。
4.2.2　内标液的制备　精密称取正十四烷0.5 g，加乙酸乙酯溶解并定容至20 mL，作为内标液。
4.2.3　标准曲线的制备　精密吸取紫苏醛标准溶液0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.6 mL,置1 mL容量瓶中，加入内标液0.06 mL,加乙酸乙酯至刻度，摇匀。精密吸取3 μL,注入气相色谱仪，按色谱条件进行测定。以峰面积积分值之比A_i /A_s为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程:
Y=0.638 2X-0.064 8　r=0.999 6
线性范围：0.15～18.0 μg。
4.3　进样精密度试验　取2 mg^.mL^-1标准溶液，重复进样9次，结果RSD=1.3%。
4.4　方法重现性　取紫苏叶粉末5份，按样品测定方法测定，结果紫苏醛含量为2.08 mg^.g^-1,RSD=2.9%。
4.5　稳定性试验　取上述样品溶液，分别于0.5，1，3，24 h进行测定，结果RSD=1.6%。
4.6　回收率试验　精密称取紫苏叶样品0.1 g，加入一定量紫苏醛标准液，按“样品的测定”项下方法进行提取测定，结果回收率为96.85%，RSD=3.2%(n=8)。
4.7　系统适用性试验　根据GC图谱分离效果，本方法要求紫苏醛与内标物的分离度：R＞2.5，GC柱效要求：理论塔板数n>10 000。

5　样品的测定
　　精密称取紫苏叶粉末2 g，置500 mL圆底烧瓶中，加水250 mL，上部接挥发油提取器(D<1),提取器内加水至水溢入烧瓶，加石油醚2 mL，接冷凝器，加热保持回流4 h，放冷，小心吸取醚层，并用石油醚洗涤提取器上壁3～4次，合并石油醚，于25 ℃以下减压蒸干，残渣加乙酸乙酯溶解并转移至2 mL容量瓶，精密加入内标液0.12 mL，加乙酸乙酯至刻度，摇匀。精密量取3 μL,注入气相色谱仪,按色谱条件进行测定，根据回归方程计算含量,结果见表1。

表1　不同产地紫苏叶中紫苏醛的含量

注：Ⅰ.叶两面紫或叶背面紫(一面紫)
　　Ⅱ.叶两面绿色，仅叶脉叶柄紫色
　　Ⅲ.叶全绿
　　Ⅳ.老叶带茎果,分辨不出颜色,挑选叶进行测定

6　讨论
6.1　紫苏叶含较多的叶绿素,冷浸、超声提取和热提均无法排除色素的干扰;采取挥发油提取法可以尽可能减小干扰因素,并且保护色谱柱。
6.2　用挥发油提取器进行提取，提取器内分别加乙醚、乙酸乙酯、己烷、石油醚、苯和甲苯作为萃取溶剂，结果以石油醚萃取效果最佳。
6.3　提取溶剂蒸干温度选择　精密量取紫苏醛标准液0.1 mL，加石油醚5 mL，分别于不同温度下减压蒸干溶剂，按样品测定方法进行测定，结果以25 ℃以下减压蒸干溶剂回收率最高。
6.4　中医药传统认为紫苏叶以叶大,色紫,气味香浓者为佳^［4］，本研究结果表明,叶大色紫气味香浓者紫苏醛含量较高；叶两面绿色或仅叶脉紫色者气味较弱，含量较低；叶全绿者几乎不含紫苏醛；近2年收集的药材紫苏叶均掺有梗或嫩枝,而且大多是结籽期后采集,气味较弱,含量较低；早年收集的紫苏叶几乎不含梗或枝，但因为放置日久，气味极弱，含量较底。此结果为采收高质量的紫苏叶以及今后的引种栽培提供了依据。
6.5　因其特殊结构，紫苏醛被普遍认为不稳定。试验中我们发现新鲜制备的紫苏醛充氮气密封并低温保存，3个月TLC未见杂质点（更长时间有待进一步验证）；配制成溶液低温放置，3个月TLC未见杂质斑点。
致谢：衷心感谢医科院药物所陈世智研究员和方洪钜研究员、药植所余竞光研究员的悉心指教。

王玉萍（中国协和医科大学中国医学科学院药用植物研究所　北京　100094）
朱兆仪（中国协和医科大学中国医学科学院药用植物研究所　北京　100094）
杨峻山（中国协和医科大学中国医学科学院药用植物研究所　北京　100094）
何伟（中国科学院植物研究所　北京　100093）