金银花中3种有机酸的反相高效液相色谱法定量分析

目的：建立用反相高效液相色谱内标法梯度洗脱同时测定金银花中绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸含量的方法，并对4个产地3种金银花中上述3种化合物进行定量分析。方法：采用岛津CLC-ODS柱(6.0 mm×150 mm)，甲醇-10%的磷酸氢二钠和醋酸缓冲液流动相不同比例进行梯度洗脱，内标物为水杨酸，检测波长304 nm。结果：西南地区金银花药材主流商品灰毡毛忍冬、细毡毛忍冬干燥花蕾中绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸含量高于山东、河南产金银花。结论：本法灵敏快速，准确可靠。
关键词　金银花　反相高效液相色谱法　绿原酸　咖啡酸　3，5-二咖啡酰奎尼酸

　　金银花为我国常用中药，具有清热解毒、散风消肿的功能，常用于外感风热、流行感冒、疖疮痛肿、乳腺炎、痢疾诸病。
　　金银花在我国分布广泛，植物来源复杂。据报道^［1，2］，全国除忍冬(Lonicera japonica Thunb.)外，尚有20余种植物的花蕾在不同地区作为金银花入药，皆为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物。其中，灰毡毛忍冬L.macrathoides Hands.-Mazz.和细毡毛忍冬L.similis Hemsl.在西南地区大量栽培使用，为西南地区金银花主流商品。
　　绿原酸(chlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)、异绿原酸(isochlorogenic acid)是金银花的主要活性成分。异绿原酸是一混合物^［3］，而3，5-二咖啡酰奎尼酸(3,5-O-dicaffeoylquinic acid)为其主要成分。据报道^［4］，绿原酸类化合物具有抗菌、利胆、止血、增加白血球等药理作用，并且有显著增强胃肠蠕动和促进胃液分泌的药理作用；咖啡酸为绿原酸的水解产物，也具有升白、止血、利胆的作用，近年研究还发现其具有镇咳、祛痰作用。它们的分子结构相似，在进行含量测定时常难分离，通常的分离方法难以达到同时测定这3种主要活性成分的目的。
　　为了探讨不同产地不同品种药材在成分含量上的差异，开发生药资源，本文建立了用反相高效液相色谱内标法梯度洗脱同时测定绿原酸、咖啡酸和3，5-二咖啡酰奎尼酸的含量。
1　仪器和试药
　　岛津制作所：LC-10A高效液相色谱泵，SPD-10A紫外可见光检测器，C-R7Ae plus处理器，CLC-ODS柱(6.0 mm×150 mm)；超声波清洗仪(上海船舶电子设备研究所)；LG15-W高速离心机(北京医用离心机厂)；水为超纯水；甲醇为分析纯，重蒸后使用；醋酸、磷酸氢二钠为分析纯。
　　绿原酸、咖啡酸和3，5-二咖啡酰奎尼酸对照品均由作者自制，并经mp、MS、¹HNMR、¹³CNMR证实，纯度达99.0%以上；内标物水杨酸购自中国药品生物制品检定所。
　　山东产忍冬干燥花蕾：购自山东省平邑县；河南产忍冬干燥花蕾：购自河南省密县；细毡毛忍冬干燥花蕾：购自重庆市酉阳县；灰毡毛忍冬干燥花蕾：购自重庆市秀山县。所有样品均为栽培品，经华西医科大学生药教研室岳松健教授鉴定后打粉，过40目筛备用。
2　色谱条件
2.1　内标物的选择　由于水杨酸与绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸同属有机酸，性质相近，并且水杨酸性质稳定，价格便宜，易于购买，因此本方法选择水杨酸为内标物。
2.2　检测波长的选择　分别取绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸和内标物水杨酸各配制成一定浓度的溶液，进行紫外-可见光扫描，波长200～700 nm。由扫描图可知，虽然绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸在326 nm左右有最大吸收，但内标物水杨酸在此处无吸收。而这4个化合物在304 nm处均有较强吸收。因此本方法选择检测波长为304 nm。
2.3　流动相　甲醇-10%的磷酸氢二钠和醋酸缓冲液(取磷酸氢二钠1.43 g，加入醋酸1.58 mL后，用水稀释至1 000 mL，即得pH=2.7的磷酸氢二钠-醋酸缓冲液)不同比例进行梯度洗脱：0→20 min，甲醇在流动相中的浓度(C)从15%上升至40%；20→25 min，C保持在40%；25→25.1 min，C从40%降至15%；25.1→35min，C保持在15%。流速1.0 mL^.min^-1。
2.4　其它条件　柱温35 ℃，以绿原酸计算柱效为8653。对称因子绿原酸为1.034；咖啡酸为0.986；3，5-二咖啡酰奎尼酸为1.015。对照品及样品色谱图见图1。

图1　对照品(A)及样品(B)色谱图
1.绿原酸(8.1 min)　2.咖啡酸(10.8 min)
3.水杨酸(14.0 min)　4.3，5-二咖啡酰奎尼酸(20.4 min)

3　标准曲线的制备
　　精密称取绿原酸约10 mg，咖啡酸约2.5 mg，3，5-二咖啡酰奎尼酸约3 mg，水杨酸约30 mg分别置于10，25，10，100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，即配成浓度分别为0.947，0.100，0.304 mg^.mL^-1的对照品溶液及0.305 3 mg^.mL^-1的内标溶液。
　　分别精密量取绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0 mL至8个10 mL容量瓶中，各加入水杨酸内标液1 mL，用甲醇稀释定容，分别取10 μL进样。
　　分别以各对照品与内标物进样浓度(mg^.mL^-1)比为横坐标，峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸标准曲线回归方程分别为：
Y=1.200 4X-0.221　r=0.999 2
Y=6.127 9X+0.099　r=0.999 1
Y=0.968 3X-0.0799　r=0.998 6
　　检测限分别为0.19～1.9，0.02～0.2，0.06～0.6 ng。
4　加样回收率实验
　　精密称取细毡毛忍冬粉末0.25 g 4份，其中3份分别加入一定量的绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸对照品溶液，再按照“样品测定”项下操作，测定各成分含量，计算回收率，结果绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸回收率分别为98.32%，97.43%，98.14%；RSD分别为0.86%，1.1%，0.73%，n=3。

　　日内、日间精密度：取绿原酸对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、3，5-二咖啡酰奎尼酸对照品溶液、内标溶液各1 mL混合，稀释至10 mL。每次进样10 μL，同一天重复测定6次，经计算得浓度平均值的RSD分别为0.62%，1.1%，0.76%；连续重复测定3天，每天3次。浓度平均值的RSD分别为0.53%，0.93%，1.2%。
6　重复性实验
　　精密称取细毡毛忍冬粉末0.25 g 6份，按照“样品测定”项下操作，测定绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸含量，计算含量的RSD分别为0.35%，1.6%，0.92%(n=6)。
7　样品测定
　　精密称取样品粉末各0.25 g，加入甲醇10 mL浸泡1 h，超声提取45 min，过滤，加入内标溶液2.5 mL，定容至25 mL，精密吸取2 mL稀释至10 mL。取2 mL，离心20 min，转速10 000 r^.min^-1，取0.5 mL上清液为样品溶液，吸取10 μL进样，测定样品中绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸的含量，结果见表1。

表1　不同金银花中3种有机酸的含量(%，n=3)

8　讨论
8.1　绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸的结构相近，用一般分析方法很难分离测定。本文首次建立了采用高效液相色谱内标法梯度洗脱同时测定3个化合物含量的方法。该方法稳定、快速准确，可适用于中药材及中成药中这3种化合物的含量测定。
8.2　绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸长时间超声提取可能会由于受热分解而导致含量下降，因此提取时间不宜过长。本实验以超声提取45 min为宜。
8.3　绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸是金银花的主要活性成分，因此以往只考察某一化合物如绿原酸含量的方法是不够的。另一方面由于植物来源、产地或加工方法不同，常导致这3种化合物的含量有所变化。因此，同时考察这3种化合物的含量对生药的品质评价是十分重要的。
8.4　本实验测定的结果表明，重庆秀山产灰毡毛忍冬花蕾中绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸含量最高，其次是重庆酉阳产细毡毛忍冬，而山东产、河南产忍冬花蕾中这3种化合物含量最低。传统观念认为河南、山东产金银花优于西南地区金银花，但就金银花主要有效成分绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸含量为指标判断，西南地区金银花药材主要品种灰毡毛忍冬和细毡毛忍冬干燥花蕾反而优于山东、河南产金银花，这对于进一步开发西南地区的生药资源是很有意义的。

王天志（华西医科大学药学院　成都　610041）
李永梅（华西医科大学药学院　成都　610041）
王志霄（华西医科大学药学院　成都　610041）

参考文献