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目的：建立一种莫海林分子量及其分布测定的质控方法。方法：采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)，色谱柱为Shodex Asahipak GF-510HQ(7.6 mm×300 mm)，以已知分子量的葡聚糖(Dextran)为标样，0.2mol.L-1硫酸钠(稀硫酸调至pH 5.0)为流动相；柱温35 ℃；流速0.5 mL.min-1；示差折光检测器。结果：利用GPC软件处理，得到莫海林的数均、重均分子量和分子量累积重量分布曲线。结论：本文所建立的HPGPC法简便、快速、重现性好，适合于该类药物的质量控制。
关键词 高效凝胶渗透色谱法 平均分子量 分子量分布 莫海林
由于多糖的理化性质和生理活性与分子量有很大关系，所以在多糖类药物的质量检测上，分子量是一个重要指标。分子量测定方法很多，但大多存在实验繁琐，仪器昂贵，实验数据波动大等缺点［1］。70年代出现了耐压合成凝胶，使用合成凝胶的高效液相色谱法，通常被称为高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)，用HPGPC法测定多糖纯度和分子量及其分布，具有快速、高分辨和重现性好等优点，在国内外已得到广泛应用［2～4］。
莫海林(原名改构肝素，净脉灵，降脂宁)是由肝素经化学修饰获得的改构肝素，属于类肝素药物［5］。临床研究表明该药能降低血清胆固醇，刺激脂蛋白酶的释放，促进脂性血浆的净化，可用于治疗高血脂症及动脉粥样硬化等症。作为多糖类药物，该药一直没有分子量控制指标。本文建立了HPGPC测定莫海林原料和片剂分子量及其分布的方法，试为该药质量标准的提高和完善提供依据。
1 仪器和试药
日本岛津LC-10AT泵，RI-6A示差折光检测器，CBM-10A接口，DGU-4A脱气装置，CTO-10A恒温柱箱，CLASS-LC10系统软件和GPC专用软件。Millipore超纯水器。
莫海林原料和莫海林片各6批，由无锡生物化学制药厂提供。标样为葡聚糖(Dextran,Fluke产品)系列，重均分子量(Mw)分别为1 270，5 220，11 600，23 800和48 600；叠氮化钠(NaN3)为进口超纯试剂；葡聚糖2000为Sigma产品；无水硫酸钠、无水葡萄糖为国产分析纯试剂。
2 色谱条件的选择
色谱柱：凝胶色谱柱选用Shodex Asahipak GF-510HQ柱(300 mm×7.6 mm)，分子量排阻范围为1 000～300 000。
流动相：先后以超纯水(电阻为17.0 mΩ)，0.1 mol*L-1硝酸钠溶液，0.2 mol*L-1硫酸钠溶液用硫酸调pH至5.0(按BP1994 1336页配制)为流动相，根据样品的溶解度、折光率、出 峰时间和峰形等因素综合考虑，最后选 定pH 5.0的0.2 mol*L-1硫酸钠溶液作为流动相。
柱温：由于检测器检测温度为35 ℃，为了使样品HPGPC图谱基线稳定，选用柱温为35 ℃。
流速：0.5 mL*min-1，进样量：25 μL。
3 标准曲线的绘制
根 据文献报道［6］，肝素分子 量为3 000～40 000，莫海林作为改构肝素其分子量也在此范围，故选用上述分子量范围的标准品。由于缺乏肝素分子量标准品，所以改为选Dextran标样。分别取5个不同分子量的标样，加流动相制成10 mg*mL-1的溶液作为标准溶液。分别取25 μL进样，记录色谱图得保留时间tR，应用GPC软件绘制标准曲线。其回归方程为：
logMw=8.880-0.323tR r=0.996 n=5
4 HPGPC系统重现性的考察
为考察HPGPC系统的重现性，将莫海林原料(970901批号)重复进样5次，HPGPC图谱见图1，tR、Mw、Mn分别为12.292 min(RSD=0.02%)、22 591(RSD=0.11%)、11 052(RSD=0.18%)。
图1 莫海林HPGPC图谱
结果表明，本实验所用HPGPC系统具有较好的重现性，各参数RSD均小于1%。
5 样品测定
原料测定：精密称取莫海林原粉适量，加流动相溶解，制成约10 mg*mL-1的溶液，滤过，放置过夜。取25 μL进样，记录色谱图。
片剂测定：取莫海林片5片，研细。转移至试管中，加流动相5 mL，振摇10 min，滤过，放置过夜。同原料方法测定。
6 结果与讨论
6批莫海林原料和6批莫海林片得到的色谱图基本一致，见图1，均为2个峰，前面的峰为莫海林，一个馒头峰；后面的尖峰为小分子杂质，分子量计算时不计。采用GPC软件处理上述色谱图得到Mn、Mw、分布宽度(Mw/Mn)、分子量累积重量分布曲线。结果见表1、表2。
表1 6批莫海林原料分子量(n=3)
|
批号 |
Mn |
Mw |
Mw/Mn |
|
970901 |
11 061 |
22 579 |
2.04 |
|
970902 |
11 179 |
23 087 |
2.06 |
|
970903 |
10 899 |
22 046 |
2.02 |
|
971101 |
11 669 |
23 689 |
2.03 |
|
971102 |
11 709 |
22 950 |
1.96 |
|
971103 |
11 302 |
22 379 |
1.98 |
|
X-±RSD |
11 303±2.3% |
22 788±2.1% |
2.02±1.4% |
表2 6批莫海林片的分子量(n=3)
|
批号 |
Mn |
Mw |
Mw/Mn |
|
970901 |
8 912 |
19 165 |
2.15 |
|
970902 |
8 916 |
18 991 |
2.13 |
|
970903 |
9 066 |
19 212 |
2.12 |
|
971101 |
9 004 |
18 728 |
2.08 |
|
971102 |
9 267 |
18 626 |
2.01 |
|
971103 |
9 274 |
18 456 |
1.99 |
|
X-±RSD |
9 073±1.4% |
18 863±2.1% |
2.08±2.6% |
由表1、表2结果可见，莫海林原料平均Mn为11 303±258，平均Mw为22 788±469，分布宽度为2.02±0.03；莫海林片的平均Mn为9 073±132，平均Mw为 18 863±260，Mw/Mn为2.08±0.05。莫海林原料和片剂的各分子量RSD均小于3%，说明各个批号莫海林分子量和分子量分布是近似的，该产品的生产工艺是稳定的。但由于片剂中淀粉辅料的干扰，片剂色谱图莫海林峰前移，在扣除空白淀粉峰后计算得到的莫海林分子量较原料结果偏低。
为了进一步了解莫海林产品中各级分分子量和相对含量，更好地对产品进行质量控制，本文在测定了分子量基础上，进一步分析了其分子量分布，得到分子量累积重量分布曲线(图2)。
图2 莫海林原料970901(A)及片剂970901(B)
分子量累积重量分布曲线
对于单一组分该曲线为S型，其纵坐标为百分含量，横坐标为分子量的对数值。从图2可直观了解该样品分子量分布宽窄，可查得某一分子量级分的相对含量。
7 小结
本文采用HPGPC法分析了莫海林产品6批原料和6批片剂，测得该产品Mn、Mw和Mw/Mn，为该药品质控积累了数据。实验研究表明，该法具有简便、快速和重现性好等优点，适合于该药品的分子量控制。本文方法已增订到该品种部颁标准中。
范慧红（中国药品生物制品检定所 北京 100050）
刘金秀（中国药品生物制品检定所 北京 100050）
徐康森（中国药品生物制品检定所 北京 100050）
参考文献