血浆中单硝酸异山梨酯的高效液相色谱法测定

目的：建立了高效液相色谱法测定血浆中单硝酸异山梨酯浓度。方法：采用硅胶分析柱,以二氯甲烷-正己烷-乙腈-甲醇(92∶4∶1.5∶2.5)为流动相,卡马西平作内标。样品在碱性条件下用二氯甲烷萃取浓集后进样, 234 nm波长下检测,按内标法定量。结果：标准曲线在25～1600 μg^．L^-1范围内有良好线性，最低检测浓度为10 μg^．L^-1，方法回收率为96%～104%，日内RSD小于4.5%，日间RSD小于5%。结论：本法具有快速简便，灵敏准确等特点，已用于单硝酸异山梨酯缓释制剂生物利用度测定，结果良好。
关键词　单硝酸异山梨酯　高效液相色谱法　血药浓度

单硝酸异山梨酯(ISMN)为硝酸异山梨酯的主要活性代谢产物,可通过扩张外周血管、特别是增加静脉血容量,减少回心血量、降低心脏前后负荷而减少心肌耗氧量,同时还可通过促进心肌血流重新分布而改善缺血区血流供应。ISMN与硝酸异山梨酯相比除药理活性相同外,还具有吸收迅速、作用持久、没有首过效应。目前ISMN的普通片剂已广泛应用于临床,为考察ISMN控释片的相对生物利用度及了解药代动力学参数,本文建立了测定血浆中ISMN的高效液相色谱法。有关血中ISMN测定，文献报道均用气相色谱-电子捕获法^［1～3］，高效液相色谱法仅见制剂中ISMN含量及杂质测定^［4，5］。

1　仪器与试药

1.1　仪器与色谱条件　Waters 680型(包括486可变波长紫外检测器, 510型高压泵,7725型进样阀),使用Nuclbosil 5 silica 100A(250 mm×4.6 mm,5 μm，大于20 000塔板)不锈钢分析柱,岛津C-R7Ae型色谱数据处理机。以二氯甲烷-正己烷-乙腈-甲醇(92∶4∶1.5∶2.5)为流动相, 流速1.0 mL^.min^-1,检测器波长234 nm,灵敏度为0.005 AUFS。
1.2　药品与试剂　ISMN由成都华西药业有限公司提供(山东省医药工业研究所生产), 纯度100.3%;内标用卡马西平（中国药品生物制品检定所）。二氯甲烷（分析纯,用前经纯化处理并重蒸馏）,乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。
1.3　标准溶液　准确称取ISMN 10.0 mg及卡马西平10.0 mg, 分别置于2个50 mL容量瓶中,加乙腈溶解并定容至刻度即成ISMN和内标卡马西平贮备液(200 mg^.L^-1),-20　℃保存可稳定2个月,临用时将贮备液用重蒸水稀释至所需浓度,即得ISMN系列工作液(8 000,4 000, 2 000, 1 000, 500, 250, 125 μg^.L^-1)和内标稀释液(126 μg^.L^-1)。

2　方法与结果

2.1　标准曲线　取正常人空白血浆各0.5 mL共7份, 分别加入ISMN标准系列工作液100 μL,使各管血浆浓度分别为1 600，800，400，200，100，50，25 μg^.L^-1,再分别加入内标稀释液100 μL, 0.25 mol^.L^-1氢氧化钠溶液100 μL, 混匀后用二氯甲烷3.0 mL涡旋混合萃取3 min, 离心(3 000 r^.min^-1)5 min, 负压吸弃上层液,倾二氯甲烷于尖底试管内,于40 ℃水浴中通空气流挥干, 残渣溶于100 μL流动相,进样50 μL。由ISMN与卡马西平的峰高比(Y)对ISMN浓度(X)作标准曲线, 计算得回归方程为:
Y=0.001 289　X-0.000 129　r=0.999　1
表明在血药浓度25～1 600　μg^.L^-1范围内有良好线性关系。
2.2　样品测定　取受试者血浆样品 0.5 mL, 加入重蒸水100 μL, 按标准曲线制备项下操作, 在标准曲线上求出各样品中ISMN浓度。
2.3　保留时间及检测限　空白及样品血浆色谱图见图1,ISMN及内标卡马西平的保留时间分别为6.4 min（16 000塔板）和7.0 min（分离度为2.2）。ISMN的最低检出量为2 ng, 最低检出浓度为10 μg^.L^-1(以信噪比≥3计)。
2.4　方法精密度　取含ISMN高、中、低3种浓度的样品,于同日内连续测定5次,RSD分别为3.4%，4.3%，3.1%; 2周内重复测定5次, RSD分别为4.8%，4.2%，4.2%。
2.5　方法回收率　取空白血浆3份, 配成含ISMN高、中、低3种浓度的样品，每个浓度样品分成5份按前述样品测定法测定, 计算方法回收率, 结果见表1。

图1　色谱图
a.空白　b.正常人口服ISMN控释胶囊50 mg后5 h
1.ISMN　2.内标卡马西平

表1　方法回收率

3　讨论

3.1　色谱柱选择　ISMN极性较大，用烷基柱和氰基柱测定时，所用流动相中水相比例高，前述提取法处理的样品进样杂质峰保留时间长，改用硅胶柱后，杂质大多在5 min内出峰，不干扰测定，且药物峰峰形好，有利于提高检测灵敏度。
3.2　检测波长选择　ISMN无明显紫外吸收峰，仅在近紫外区有吸收（见图2），为提高检测灵敏度，检测波长应越短越好，但由于流动相所用二氯甲烷在近紫外区吸收明显增高,综合二者因素，本文采用234 nm测定既不使流动相本底吸收太高（本底吸收值0.50），又能达到测定血浆中ISMN灵敏度要求。

图2　ISMN紫外吸收曲线
40 mg^.L^-1甲醇-水(1∶4)溶液

3.3　萃取条件选择　按赵弈等人报道^［3］，在pH 7.0缓冲液存在下用乙酸乙酯提取，紫外检测杂质峰较多，本文用二氯甲烷提取，回收率与乙酸乙酯相当，但杂质峰较少，且在碱性条件下提取比中性条件下杂质峰更少。
　　本文建立的测定血浆中ISMN的高效液相色谱法具有操作简便、所用仪器较为普及、灵敏度、精密度、准确性均能满足临床用药动学和生物利用度研究的需要，已用于缓释制剂的生物利用度测定，结果准确可靠，为ISMN血浆中浓度测定提供了一种新的选择。

王建新：华西医科大学药学院博士生
秦永平（华西医科大学附属第一医院临床药理研究室　成都　610041）
邹远高（华西医科大学附属第一医院临床药理研究室　成都　610041）
梁茂植（华西医科大学附属第一医院临床药理研究室　成都　610041）
黄英（华西医科大学附属第一医院临床药理研究室　成都　610041）
余勤（华西医科大学附属第一医院临床药理研究室　成都　610041）
王建新（华西医科大学附属第一医院临床药理研究室　成都　610041）

参考文献

1　黄小芳，朱英姿，崔宝东等，毛细管气相色谱—电子捕获法测　　定5-单硝酸异山梨酯血药浓度的研究. 中国药学杂志，1998，33（10）：608
2　夏桂珠，傅贻柯，董善年等. 毛细管气相色谱-电子捕获法测定人血清中5-单硝酸异山梨醇酯的浓度和药代动力学参数. 药学学报，1994，29（8）：634
3　赵奕，周莹，袁虹等. 5-单硝酸异山梨醇酯片在人体的药代动力学和生物利用度的研究. 中国临床药理学杂志，1995，11(1):33
4　Agbaba D, Janjic V, Zivanov-stakic D, et al. High performance liquid chromatographic assay for isosorbide 5-Mononitrate and impurities of inorganic nitrates in pharmaceuticals. J Liquid Chromatogr，1994,17(18):3983
5　张晓东，白秀梅，王建平. 高效液相色谱法测定5-单硝酸异山梨醇酯片含量. 中国药科大学学报，1993，24（4）：229