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目的:建立中药何首乌专属性成分的测定方法。方法:应用低压柱色谱法,从中分离得到羟芪衍生物—2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷,并以此对照建立了测定方法。结果:采用C18色谱柱,25%乙腈为流动相,320 nm检测。线性关系考察,回归方程为:Y=1 024.04+1 588 084.61X,r=0.999 9。加样回收率平均值为99.76%,RSD=1.22%(n=5)。结论:本法简便、灵敏、专属性强,为何首乌及制首乌的质量评价提供了有效的方法。
关键词 何首乌 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 高效液相色谱法
何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)为常用中药,药用历史悠久。在中医临床,生首乌解毒、消痈,润肠通便;制首乌补肝肾,益精血,乌须发,强筋骨[1]。现代药理研究证明其具有抗衰老、降血脂等多种药理活性,临床用于防治衰老及动脉粥样硬化、高血压、慢性气管炎、糖尿病、神经衰弱等中老年疾病[2]。
何首乌含有的化学成分主要有蒽醌类、羟芪衍生物及磷脂类等。以往中成药质量标准中大多以蒽醌类作为含量指标。由于其含有的蒽醌类成分,如大黄素、大黄酚等在同属大黄、虎杖等药材中也含有,因此作为指标成分专属性较差。
在何首乌质量标准研究中,我们分离、鉴定了其中含量较高的羟芪类成分—2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。据文献报道[2]该成分为抗衰老、降血脂药理药效的活性成分,且为何首乌的特征成分。为此,进一步建立了高效液相色谱法测定2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的方法,并测定了生首乌和制首乌商品药材,为首乌药材的质量评价提供了一新的指标和方法。
1 仪器和试药
高效液相色谱仪(日本岛津):LC-10AD泵;SPD-M10A二极管阵列检测器;CLASS-10A色谱工作站。
试剂:乙腈为色谱纯,乙醇、甲醇等为分析纯。
药材:生首乌、制首乌药材由本所及湖南、浙江、广西、云南、四川、河南、广东等省药品检验所协助采集或收购。经本所中药标本馆张继主管药师鉴定。
对照品:自行提取、分离制备,经UV、IR、NMR光谱测定,数据与文献[3]一致。高效液相色谱归一化法纯度大于98.0%。
2 色谱条件
色谱柱:Platinum(Alltech)C18,5 μm,4.6 mm×250 mm;流动相:25%乙腈,1 min。mL-1检测波长:320 nm。进样量10 μL。
3 供试品溶液的制备
取本品粉末(过4号筛)0.2 g,精密称定,精密加入50%乙醇25 mL,水浴加热回流30 min,放冷,补足失重,上清液以0.45 μm滤膜滤过,即得。按上述色谱条件测定的色谱图见图1。
图1 样品色谱分离情况
a.2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷
4 方法学考察
4.1 线性关系考察 取对照品适量,精密称定,加50%乙醇溶解并稀释制成0.45 mg。mL-1对照品溶液。取2,4,6,8,10 μL进样,以上述色谱条件测定峰面积值,结果以进样量为横坐标(X),以峰面积值为纵坐标(Y)进行线性回归,得回归方程为:
Y=1 024.04+1 588 084.61X r=0.999 9
结果显示:在0.90~4.50 μg范围,对照品量与色谱峰面积值呈良好线性关系。
4.2 色谱峰峰纯度和光谱一致性测定 以上述提取方法及色谱条件得到的结果,供试品溶液中与对照品相应的色谱峰,峰纯度系数为0.999 1;供试品中与对照品相应色谱峰的光谱相似性系数1.000 0。
4.3 最小检出量 将上述对照品溶液稀释至0.001 8 mg。mL-1,进样1 μL(0.001 8 μg),仍可检出大于基线噪音3倍量的色谱峰。
4.4 重复性测定 取样品5份,按“3.4”项制备供试品溶液,并按上述色谱条件测定含量,结果平均含量为2.38%,RSD为2.28%(n=5)。
4.5 回收率测定 取已测知含量(2.38%)的样品0.1 g,精密称定,精密加入对照品溶液(0.122 mg。mL-1)25 mL,照上述方法提取、测定5次,结果平均回收率为99.76%,RSD为1.22%。
5 样品含量测定
应用上述方法,对9份生首乌和7份制首乌样品中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量进行了测定,结果见表1。
表1 样品测定结果 |
生首乌 |
制首乌 | ||
产地 |
含量/% |
产地 |
含量/% |
河北安国 |
6.348 | ||
湖北宜昌 |
5.180 | ||
广东 |
1.777 |
广东 |
3.304 |
浙江 |
1.086 |
浙江 |
0.140 |
广西百色 |
0.143 |
广西隆林 |
1.163 |
四川 |
6.852 |
四川 |
4.709 |
河南 |
3.309 |
河南 |
0.392 |
云南 |
0.697 |
云南 |
3.070 |
湖南 |
5.874 |
湖南 |
2.307 |
6 讨论
6.1 关于流动相系统,曾先后试验了25%,30%,35%,40%甲醇;20%,25%,30%乙腈等,结果以25%乙腈系统,色谱分离的峰纯度最高,与其它成分的色谱峰分离良好。关于检测波长,以二极管阵列检测器测定2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰的光谱吸收曲线,其在(320±1) nm有最大吸收,因此选择检测波长为320 nm。
6.2 测定用生首乌药材粉碎,分别过2号、4号筛,以上述色谱条件测定含量。结果:过2号筛样品粉末与颗粒不均匀,加之取样量较少,平行测定结果差异较大;而过4号筛样品测定结果均匀性良好。因此,样品需过4号筛后取样测定。
6.3 供试品提取方法,曾先后以甲醇、30%甲醇、25%乙腈、50%乙醇超声提取,结果50%乙醇提取率最高;又以50%乙醇超声提取和加热提取进行比较,结果以加热提取测定结果较高。因此,确定采用50%乙醇加热提取的方法。
6.4 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷成分对光不稳定,试验中比较了避光与不避光操作对含量测定的影响,结果(表2)表明整个操作应避光进行。
表2 避光与不避光操作的比较(%)
放置时间/h |
避光 |
不避光 |
0 |
2.294 |
2.296 |
4 |
2.342 |
2.154 |
24 |
2.359 |
2.030 |
RSD/% |
1.43 |
6.16 |
6.5 对9份生首乌样品的测定结果表明样品中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量差异较大。其中,广西百色、云南2份样品较低。这2份样品,外形上也与传统药材有较大差异(“云锦花纹”不明显,有一明显木心)。据鉴定,与近年药材市场上出现的类似物相似,可能来源于同属或近缘植物,有待深入研究。
6.6 所测的7份制首乌样品,含量差异也较明显。这里有药材来源的因素,也有炮制加工方法的影响。我们拟进一步对制首乌的炮制方法进行考察,以制定合理的限量标准。
鲁静(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
粟晓黎(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
董海荣(承德中药厂 河北 067000)
李民生(山西省药品检验所 太原 030001)
参考文献
1,中国药典.1995.一部:149
2,邓文龙,龚世蓉. 何首乌研究进展.中草药,1987,18(3):42
3,李建北,林茂.何首乌化学成分的研究.中草药,1993,24(3):115