高效凝胶色谱法测定重组人白介素-11的含量

目的：建立重组人白介素-11的高效凝胶色谱含量测定方法。方法：采用外标法，色谱柱：Biosep SEC-S2000(300 mm×7.8 mm)，流动相：0.2 mol^.L^-1磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，流速：0.5 mL^.min^-1，检测波长：280 nm。结果：线性范围：2.5～30 μg(r=0.999 0)，平均回收率101.1%～101.9%(RSD＜1.8%，n=9)。精密度：RSD=0.75%(n=5)；最低检测限0.15 μg。结论：该法用于测定重组人白介素-11的含量，简便，准确，重现性好。
关键词　重组人白介素-11　高效凝胶色谱法

白细胞介素-11(Interleukin-11)是90年代初研究发现的一类多功能造血调控因子，临床上用于因化疗引起的血小板减少症^［1］。重组人白介素-11是利用基因工程技术在大肠杆菌中表达生产的重组蛋白类药物，它具有白细胞介素-11的生物功能。其蛋白含量是基因工程产品的重要质控指标之一^［2］。常用的蛋白含量测定方法有紫外法、Lowry法、氨基酸分析及定氮法^［3］等，紫外法需高纯度样品以获得消光系数，且大分子聚合物的存在会产生光色散作用，使结果偏高；Lowry法操作繁琐，且保护剂或赋形剂常对测定有干扰，样品需前处理；氨基酸分析及定氮法分别测定总氨基酸和总氮量，因样品中含有甘氨酸作为稳定剂，也不能直接测定。利用高效液相色谱法可直接测定蛋白含量^［4～6］，同时也能对有关杂质及赋形剂组分进行分离，方法简便快捷。本文采用体积排阻高效液相色谱法，测定重组人白介素-11含量，得到满意结果。
1　仪器及材料
　　Beckman液相色谱仪：126 Solvent Module输液泵、168二极管阵列检测器、Gold色谱处理系统；Millio超纯水装置；对照品：重组人白介素-11冻干粉(NEUMEGA，Genetics Institute公司)；样品：重组人白介素-11半成品及其粉针分别由国内不同厂家提供；空白样品溶液(pH 7.0磷酸盐缓冲液含2.3%甘氨酸)由厂家提供；所用水为Millio超纯水，其余试剂均为分析纯。
2　色谱条件
　　色谱柱：Phenomenex Biosep SEC-S2000(300 mm×7.8 mm)；流动相：0.2 mol^.L^-1磷酸盐缓冲液(pH 6.8)；流速：0.5 mL^.min^-1；柱温：室温(25 ℃)；检测波长280 nm；进样20 μL。
3　实验条件选择
3.1　色谱柱　试用了Phamacia Biotch Superose 12H/30及Biosep SEC-S2000 2种型号的分子筛柱：以对二聚体的分离为主要考察指标，结果SEC-S2000柱能够分离二聚体，而Superose 12H柱在所选择系统中，经改变pH及离子强度，虽能获得较好柱效，但不能分离二聚体。故选择SEC-S2000作为分析柱。
3.2　流动相　分别对流动相的组成、离子强度、pH及流速等因素进行了考察。试用了磷酸盐、碳酸氢氨及含SDS的溶液系统，结果用0.2 mol^.L^-1磷酸盐(pH 6.8)溶液分离效果较好；降低离子强度(小于0.1 mol^.L^-1时)，保留时间不变，但柱效降低；低流速对分离有利，但保留时间相应延长，试验了0.4～1.0 mL^.min^-1不同流速，以0.5 mL^.min^-1较好。
3.3　检测波长　经二级管阵列检测，重组人白介素-11分别在280 nm及214 nm处有最大吸收，同一样品在214 nm和280 nm处检测，其峰面积的RSD分别为1.8%和0.75%(n=5)，故本实验选择280 nm作为检测波长。
3.4　系统适应性试验　取重组人白介素-11冻干粉适量于60 ℃烘箱中加热5 d，取出，用水溶解，制成1 mg^.mL^-1溶液，取20 μL注入液相色谱仪，色谱图见图1。在所选色谱条件下分离度(以重组人白介素-11单体和二聚体之间的峰谷高与二聚体峰高之比来计算)为0.2；理论塔板数以重组人白介素-11峰计算为9 000。

图1　空白样品(A)、冻干粉(放大)(B)、冻干粉(C)色谱图
1.二聚体　2.重组人白介素-11　3.空白峰

4　测定方法与结果
4.1　线性关系　取重组人白介素-11对照品适量，精密加水溶解，制成5 mg^.mL^-1溶液作为对照品储备液，-20 ℃冰箱保存，备用。精密吸取对照品储备液适量，分别用水制成0.125，0.25，0.375，0.5，0.75，1.0，1.5 mg^.mL^-1的溶液作为对照品溶液，取各对照品溶液20 μL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。在0.125～1.5 mg^.mL^-1(2.5～30 μg)时，浓度与峰面积呈良好线性关系：
Y=95 479X-47 545　r=0.999 0
4.2　精密度试验　取对照品溶液(0.5 mg^.mL^-1)20 μL，注入液相色谱仪，重复进样5次，记录峰面积，RSD为0.75%(n=5)。
4.3　回收率试验　精密吸取对照品储备液适量，用水制成2 mg^.mL^-1溶液，再分别精密吸取80，100，120 μL各3份，加空白样品液至200 μL，混匀，按含量测定项下方法测定，3种浓度回收率平均值分别为101.9%，101.5%，101.1%，RSD＜1.8%(n=9)。
4.4　最低检出限　取对照品溶液稀释成0.062 5 mg^.mL^-1的溶液，取不同量进样，当信噪比为3∶1时，测得最低检出量为0.15 μg。
4.5　样品测定　取重组人白介素-11粉针3瓶，每瓶用水制成1 mg^.mL^-1溶液，作为制剂供试液；另取半成品溶液适量，用水制成1 mg^.mL^-1的溶液，作为半成品供试液；另取对照品储备液适量，加水制成1 mg^.mL^-1的溶液，作为对照品溶液。取对照品溶液和供试液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积，按外标法以峰面积计算，3个厂家9批半成品的结果见表1，3个厂家9批制剂的结果见表2。

表1　9批半成品含量测定结果

表2　制剂含量测定结果

5　讨论
5.1　3个厂家的半成品及制剂各9个批号的含量测定结果显示，不同厂家的产品质量存在差异，厂家Ⅱ的3批半成品含量按标示量计算均低于55%。在细胞实验中也未能检出活性^［7］，提示蛋白含量与生物活性有一定相关性。由于该厂家同批制剂的蛋白含量与生物活性均符合规定，所以半成品的失活可能与储藏条件有关。高浓度有利于蛋白的稳定。
5.2　凝胶色谱是根据分子筛的原理对不同分子大小的蛋白进行分离，故本法还能同时检查高分子蛋白和水解片断。采用本法对制剂进行了分析，结果在光照条件下，杂质除二聚体外，有部分降解片段；高湿下降解片段比例增高；而加热条件下杂质主要为二聚体。
5.3　本文建立的高效凝胶色谱法可用于重组人白介素-11的含量测定，同时可作为纯度检查的手段之一。本实验结果可为产品质控方法的建立提供参考。

江帆（贵州省药品检验所　贵阳　550003）
杨化新（中国药品生物制品检定所　北京　100050）
张培培（中国药品生物制品检定所　北京　100050）
徐康森（中国药品生物制品检定所　北京　100050）