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1 适用范围
本方法适用于测定十字花含油种子不同glucosinolate的含量。
2 方法概要
在甲醇溶液中提取出glucosinolate,然后在离子交换树脂上进行纯化和酶解脱硫处理,在化相高效液相色谱上进行梯度洗脱,紫外检测器检测。
3 仪器和试剂
3.1 仪器
高效液相色谱——能梯度洗脱;柱温30℃;连有能测波长229nm的紫外检测器
高效液相色谱柱——C18或C8型;颗度小于或等于5μm。柱子应时常检验。最好用desulforglucosinolate油菜籽作参照物,此柱不能用于降解4-hydroxy glucosinolate。
双光束分光光度计——能在紫外区域使用;温控30℃;配有光路长为1cm的石英吸收池和记录系统
微型粉碎机——如咖啡粉碎机
离心机
聚丙烯试管——6mL
水浴锅——75℃±1℃
玻璃棉
Pasteur 移液管——150mm长
3.2 试剂
如未作特殊说明,所有试剂必须是分析纯的,水符合ISO3696要求。
甲醇——HPLC级70%(V/V)
醋酸钠——0.02mol/L pH=4.0
咪唑甲酸酯——6mol/L
内标:一水合黑芥子硫苷酸钾 (Mr=415.49)或在油菜籽中黑芥子硫苷酸钾自然存在的形式为glucosinolate。
流动相:
洗脱液A——经0.45μm的过滤器并经活性炭纯化的水或同一纯度的水。
洗脱液B——乙腈 HPLC级 20%(V/V)
离子交换树脂:
DEAE——琼脂糖 CL-6B;市售
DEAE——琼脂糖 (A25;悬浊液) 将10g琼脂糖A25加入到2mol/L醋酸溶液中,静置,澄清。再加入2mol/L醋酸溶液直至清液与沉淀物体积相当。
硫酸酯酶——Helix Pomatia型 H1(EC3.1.6.1)
4 方法概述
4.1 采样
推荐使用ISO5500方法
4.2 测试样品的制备
按ISO5502缩分实验室样品得到所需大小的待测试样。
按ISO771就得样品湿度和挥发份含量。
注:若湿度小于10%(m/m),继续进行glucosinolate含量测定。若湿度大于10%(m/m),于45℃下干燥后测量,直至符合要求。
4.3 glucosinolate的抽提
分别称取100mg试样于两支试管(A和B),准确至0.1mg。
将试管放在75℃水浴中加热1min后加入2mL沸腾的甲醇溶液,然后立即分别向A中加入200μL的5mmol浓度的内标,B中加入200μL的20mmol浓度的内标,继续加热10min,并定时摇动试管。然后离心3min。将清液取出至另外两支试管(A′和B′)中。然后再抽提一次。将清液一并转移至(A′和B′)中,加水使A′和B′中液体体积约5mL。将萃取液置于暗处,-18℃时可存放2个星期。
4.4 离子交换柱的准备
截取Pasteur移液管,每个试样需两根,颈部留出1.2mL空间填玻璃棉,将0.5mL充分混匀的离子交换树脂填充到交换柱中,然后用2mL咪唑甲酸酯淋洗,再用1mL水淋洗两次。
4.5 纯化和脱硫
取1mL萃取液于交换柱中,后加入1mL醋酸钠缓冲液。然后在柱子中加入75μL经蒸馏纯化的硫酸酯酶,过夜。接取洗脱液。用1mL水洗脱两次。将洗脱液混匀。若不立即测试,于暗处-18℃可存放1周。
4.6 色谱条件
流动相速度:1mL/min;柱温:30℃;检测波长:229nm
4.7 检测
desulfoglucosinolate 溶液注射量不超过50μL。
只注意面积大于总面积的1%的那些峰。
5 重现性
当最低含量为1μmol/g时,重复性误差不应超过两次平行实验结果算术平均值的10%。
当最低含量为2μmol/g时,再现性误差不应超过两次平行实验结果算术平均值的20%。
6 来源:
国际标准化组织:ISO10633-1