点击显示 收起
葛根芩连微丸具有解肌清热、止泄止痢之功效。用于治疗泄泻痢疾，身热烦渴、下痢臭秽、菌痢、肠炎等症。2000年版药典以测定其中盐酸小檗碱的含量来控制其质量。本文采用HPLC双波长法同时检测其中葛根素和黄芩苷的含量，操作简便，方法可靠，重现性好，可以作为本产品质量控制的方法。
1 仪器、药品与试剂
仪器：Waters515型高效 液相色谱 仪，2487型双波长紫外检测器，717自动进样器，Millennium32色谱管理系统，Sartorius BP211D型电子天平。
对照品：葛根素(0736-9913)、黄芩苷(1 10715-200212)对照品均由中国药品生物制品检定所提供。
药品：葛根芩连微丸(批号：20020509、20020511、20020515)广西某制约厂。
试剂：甲醇为HPLC级，磷酸为分析纯，水为亚沸蒸馏水(自制)。
2 实验方法与结果
2．1 色谱条件分析
色谱柱：Kromasil Cl8柱(4.6 inln×250 mm，5μm)，以甲醇-0.2％磷酸为流动相，梯度洗脱。检测波长λ1=250 nm(检葛根素)，λ2=315 nm(检黄芩苷)，柱温30℃，流速1.0mL/min。
2 ．2 系统适应性试验
按样品含量测定项下方法制备供试品溶液，取该供试品溶液l0μL，注入高效 液相色谱 仪测试，葛根素和黄芩苷的保留时间分别为6.0min和23.7min。理论塔板数以葛根素计不低于3000，葛根素色谱峰与相邻未知色谱峰的分离度不低于1.5，黄芩苷色谱峰与相邻未知色谱峰的分离度不低于1.6。
2．3 标准曲线的制备
分别精密称取干燥至恒重的葛根素、黄芩苷对照品适量，配制成浓度分别为160μg/mL、263 μg/mL 的对照品储备液I、Ⅱ。分别精密吸取上述储备液10.2，0.6，1.0，1.4，1.8mL，储备液I10.2，0.5，0.8，1.1，1.4，1.7mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得标准溶液系列，取10μL进样，测定。以对照品浓度对峰面积平均值作图，结果经回归分析，葛根素在32.0～288.0ng范围内有良好的线性关系，回归方程为Y=44793X+1030，r：0.9998；黄芩苷在52.6～447.1ng范围内有良好的线性关系，回归方程为Y=21793X一1050，r=0.9999。
2．4 空白干扰试验
按处方制备不含葛根、黄芩药材的样品，依供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。取阴性样品溶液、样品溶液和对照品溶液在上述色谱条件下各进样10μL，得HPLC图谱。可知，阴性样品溶液对样品溶液含量测定无干扰。
2．5 精密度试验
分别精密吸取对照品储备液I、Ⅱ各1.0，0.8 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得混合标样，取10μL进样，重复6次，以峰面积计算RSD，葛根素RSD=0.80％，黄芩苷RSD=1.46％ 。
2．6 重复性试验
取同一批样品(批号20020509)6份，分别制成供试品溶液，按含量测定法测定，结果葛根素平均含量为1.75mg/g，RSD=1.55％，黄芩苷平均含量为2.27mg/g，RSD=1.92％。
2．7 稳定性试验
精密吸取新配制的供试品溶液(批号20020509)，按样品含量测定法每隔2h取lOμL进样测定，结果葛根RSD=1．06％，黄芩苷RSD=1.15％。表明样品溶液在12h内保持稳定。
2．8 加样回收率试验
分别精密称取干燥至恒重的葛根素、黄芩苷对照品适量，配制成葛根素、黄芩苷浓度分别为176，226 μg/mL 的混合对照品溶液，作为标准加样储备液。精密称取葛根芩连微丸(批号20020509)0.05g，平行9份，分别加入上述标准加样储备液0.4，0.5，0.6 mL，再精密加入甲醇9.6，9.5，9.4 mL，每个平行3份，按供试品溶液制备方法制成加样回收样品液。取lOμL进样，以10mL中的绝对量计算加样回收率。
2．9 样品含量测定
分别精密称取3个批号的葛根芩连微丸各0.1g置于25mL锥形瓶中，精密吸取10mL甲醇加入该锥形瓶，精密称定，超声30min，放置至室温，精密称定，用甲醇补足损失的重量，摇匀，离心(12000r/min )3 min，将上清液过微孔滤膜，取续滤液10μL进样，以标准曲线计算含量，每个批号平行3份，每份进样2次。
3．1 流动相的选择
本实验比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水、甲醇-醋酸-水、乙腈-醋酸．水系统及梯度洗脱条件下对样品中葛根素、黄芩苷分离度的影响，结果发现采用甲醇-0.2％磷酸梯度洗脱时葛根素、黄芩苷即能得到良好的分离。
3．2 提取方法的比较
本实验采用了索氏提取、水浴回流、超声提取等方法来提取葛根芩连微丸中的葛根素、黄芩苷，结果发现一次超声30min，即能将二者提取完全。
3．3 方法的比较
目前文献中对葛根芩连微丸的质量控制方法主要有采用薄层扫描法或HPLC法测定其中葛根素的，也有用HPLC法同时测定其中小檗碱、巴马汀含量的；也有用二阶导数光谱法测定其中盐酸小檗碱、黄芩苷含量的 ；2000年版药典则是采用薄层扫描法测定其中盐酸小檗碱的含量。由于方中葛根为君药，功能解肌退热，升阳止泻；黄芩为臣药，功能清热燥湿，泻火解毒，用于湿热痞满，泻痢等症。因此本实验探索了采用双波长HPLC梯度洗脱法同时测定其中的葛根素、黄芩苷的含量，方法简便、快捷、可行，可以作为该产品质量控制的方法。
3．4 本实验还采用2000年版药典的方法测定了该3批制剂中盐酸小檗碱的含量，结果显示质量符合药典要求。而运用本实验方法测定该3批制剂中的葛根素、黄芩苷含量的结果与相关文献比较显示，两者含量均偏低，可能与生产过程中所使用的原料药材的质量有关。