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木立芦荟(A.arborescens M)为百合科(Lilaceae)芦荟属(Aloe)植物芦荟,原产地南非,除具观赏价值外,还含有大量对人体有益的化学成分,它具有健胃催泻、杀菌解毒、增强内脏功能、调节内分泌系统、软化血管、降低胆固醇、利尿、抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、抗溃疡、收敛皮肤、保湿、抑制黑色素生成及治疗烫伤、烧伤虫咬等多种药理作用。芦荟苷是木立芦荟的主要药用成分,芦荟苷的含量测定方法有多种,但对木立芦荟叶中芦荟苷含量及木立芦荟叶抗氧化性能的研究少见报道。为了进一步研究其应用价值,本文采用高效液相色谱法对木立芦荟叶中的芦荟苷进行了定量分析,利用流动注射化学发光法研究了木立芦荟的抗氧化性能。实验结果显示.木立芦荟具有较强的抗氧化性能,这将为进一步开发利用木立芦荟提供科学依据。
1 实验部分
1.1 仪器与实验材料
LC99型高效液相色谱仪(北京温分分析仪器开发公司,RE52CS型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),KQ-250B型超声波振荡器(昆山市超声仪器有限公司),IFFM-D型流动注射化学发光仪(西安瑞迈电子科技有限公司);pHS-3C精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)
实验材料:木立芦荟叶样品,由沈阳宝岩生物科技发展有限公司提供。
样品的处理:取三年生木立芦荟的第5位叶,洗净并吸干芦荟叶表面的水分,经阴干处理后。粉碎粒度小于1.3 mm,备用:
芦荟苷标准品:中国药品生物制品检定所提供;鲁米诺(AR级):由陕西师范大学提供。
邻苯三酚储备液:用0.01mol/LHC1将邻苯三酚配成0.01mol/L邻苯三酚储备液,使用前用水稀释至浓度为5×10m ol/L;0.01 mol/L Na2CO3一NaHCO3,缓冲溶液:用前新鲜配制,pH用酸度计准确调至9.95;5×0.00001mol/L鲁米诺储备液:用0.1mol/L NaOH溶液配制,避光处保存。所用试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。
1.2 木立芦荟样品提取液的制备
精确称取木立芦荟叶干粉2.00g放入带磨U塞的50mL锥形瓶中,加入40mL 60%(φ)甲醇,在25℃用超声波振荡器振荡40min,将所得提取液离心5min,用60%甲醇定容,过滤,续滤液过0.45μm有机微孔滤膜,得供试液。
1.3 色谱条件
色潜柱:YWG C18(200mm×4.5mm,5μm),流动相:甲醇-水(体积比55:45),流速:1.0mL/min:
检测波长:225nm,色谱柱温:30℃: 取样品供试液,按上述色谱条件进样。
1.4 氧化性测定及抑制率计算
取两支比色管分别加入5×0.00001mol/L 的邻苯三酚溶液和浓度为0.2mol/L 鲁米诺的碳酸盐缓冲溶液(pH为9.95),启动IFFM-D型流动注射化学发光仪,按图2连接流路,流速均为2.5mL/min,测出邻苯三酚-碳酸盐缓冲溶液-鲁米诺发光体系的发光,再测定木立芦荟样品抑制后的发光,取峰值平均值进行定量:发光强度以计数表示,以邻苯三酚-碳酸盐缓冲溶液-鲁米诺发光体系的发光强度为空白发光峰值,可计算出加入木立芦荟样品后抑制发光的程度。抑制率%=(I0-I)/I0×100%。其中I0-空白发光值;I-加入木立芦荟后的发光值:
2 结果与讨论
2.1 抗氧化性能测定条件的选择
2.1.1 鲁米诺浓度对抑制率的影响取浓度为5×0.00001mol/L的邻苯三酚溶液,pH为9.95的Na2C03-NaHCO3缓冲溶液,抑制实验中木立芦荟的质量浓度为5mg/mL。改变鲁米诺的用量,分别取50、100、150、200、250、500、1000μL的鲁米诺用缓冲溶液将其稀释至25 m1 进行实验。实验结果(其中I0为空白发光值,I为加入木立芦荟后的发光值),由表可以看出,鲁米诺的加入量对抑制率有一定的影响。可以看出当鲁米诺的浓度为0.2 mmol/L时木立芦荟的抑制率达到最大值。因此本实验选鲁米诺的浓度为0.2mmol/L为适宜的测定条件。
2.1.2 缓冲溶液的pH对抑制率的影响取浓度为5×0.00001mol/L的邻苯三酚溶液,浓度为0.2 mmol/L的鲁米诺溶液,抑制实验中木立芦荟的质量浓度为2mg/mL,仅改变Na2CO3-NaHCO3,缓冲溶液的pH进行实验。实验结果看出,pH对抑制率有一定的影响,当pH为9.62时抑制率达到最大值,但是其发光强度很低,灵敏度不好;当pH为l0.58时,抑制率低;当pH为9.95时,抑制率较大,而且发光强度适宜,灵敏度也比较好,便于准确读数。故本实验选pH 9.95为适宜的测定条件:
2.1.3 邻苯三酚浓度对抑制率的影响取pH为9.95的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液,浓度为0.2mmol/L鲁米诺溶液,抑制实验中芦荟的含量为2mg/mL,仅改变邻苯三酚的浓度,分别取浓度为0.O1mol/L邻苯三酚0.25、0.125、0.1、0.025 mL稀释至25mL,即得浓度为1×0.0001、5×0.00001、4×0.00001、1×0.00001mol/L的邻苯三酚溶液进行实验,实验结果可知,邻苯三酚的浓度对抑制率也有一定的影响。可以看出当邻苯三酚的浓度为5×0.00001mol/L时芦荟的抑制率达到最大值。因此本实验选邻苯三酚浓度为5×0.00001mol/L。
2.2 标准曲线绘制
精密称取芦荟苷7.2mg,用甲醇稀释,配成芦荟苷质量浓度为0.0288mg/mL的标准溶液,分别进标样10、8、6、4、2、1μL,根据进样量(m)与吸收面积(A)作标准曲线。芦荟苷回归方程:A=5.298×0.0000001m+0.0058,r=0.999 8,线性范围:0.028 8~0.288μg。
2.3 回收率及精密度实验
精密吸取已知含量的样品(5.8μg/mL),1mL3份,分别置于10mL量瓶中,各加入芦荟苷对照品溶液1 mL,按1.2节处理后进样测定,得平均回收率为102.0%。
精密吸取2.1芦荟苷对照品溶液10μL重复进样6次,测定其峰面积,计算RSD为1.24% 。
2.4 样品的测定
按1.3液相色谱测定条件,与1.2处理过程相同,测定木立芦荟叶待测样品No1、No2、No3芦荟苷的相对百分含量,结果分别为0.629%,0.637%、0.622%。
2.5 木立芦荟抗氧化性能的测定
在选定的最佳条件下,取质量浓度为5mg/mL木立芦荟溶液配制成0.20、0.25、0.33、0.50、0.63、1.00、5.00mg/mL一系列溶液进行实验。实验结果可以看出,随着木立芦荟质量浓度的逐渐增加。化学发光强度呈现逐渐降低的趋势,而抑制率则呈现逐渐增强的趋势,且呈现量效关系。木立芦荟的IC50(抑制率为50%时的溶液浓度)为0.45mg/mL,当木立芦荟的质量浓度为5mg/mL抑制率达到99.27%,说明木立芦荟具有很强的抗氧化性能。关于芦荟苷的抗氧化作用有待进一步研究。