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牛奶中抗生素主要有B-内酰胺类抗生素如青霉素、头孢菌素等和非B-内酰胺类抗生素如四环素、链霉素等。目前，分析牛奶中抗生素主要用高效液相色谱(HPLC)法、薄层扫描定量法和微生物法。HPLC法为目前常用理化监测抗生素方法，一般仅监测少数几种残留抗生素，如吡啶硫乙酰头孢菌素(cephapirin)，且检测灵敏度相对较低，易受干扰。薄层扫描定量法操作复杂、费时，且抗生素在薄层板上的荧光强度随放置时间延长而减弱，人为因素造成的测定误差较大。微生物法具有成本低，灵敏度高的特点，可检测2-150ug／L残留量的抗生素水平，但一般仅能提供定性、半定量数据，且仅可监测B-内酰胺类抗生素残留，适宜大量样品的筛选之用。
我们对牛奶中4种抗生素，即四环素(tetracycline，C22 H24 N209，相对分子质量为444.153)，土霉素(oxytetracycline，C22H24N209，相对分子质量为460.148)，金霉素(chlortetracycline，C22H23N208，相对分子质量为478.114)和氯霉素(chloramphenicol，C11H12CI2N205，相对分子质量为322.012)，用毛细管电泳法检测样品中的4种抗生素残留，其牛奶中检测限为氯霉素为10ug／L，四环素、土霉素为15ug／L，金霉素为20ug／L，为残留研究提供了既灵敏又可靠的测定方法。
一、实验部分
1、材料和试剂：四环素(TC)，土霉素(OTC)，金霉素(CTC)和氯霉素(CP)3种标准品由中国药品生物制品检定所提供；磷酸氢二钠、柠檬酸、三氯甲烷、甲醇、十二烷基磺酸钠(SDS)均为分析纯；水为去离子双重水。
2、仪器：BioFocus 3000 capillary ElectrophoresisSystem(美国BioRad公司)，毛细管分离柱总长55cm，有效长度50cm，直径75um。
3、电泳条件：经紫外检测器在190-380am波长范围内扫描，确定264nm作为检测波长。毛细管在每次使用前先用0.1 mol／L的NaOH在高压下清洗5min，后用水洗5min，再用电泳缓冲液洗2min。研究不同的缓冲液pH值、添加不同浓度的有机试剂等因素对抗生素分离效果的影响，确定最佳分离条件。
4、溶液的配制：分别准确称取4种抗生素各2．5 mg，置于25 ml容量瓶中，用三氯甲烷定至刻度，置于4~C冰箱中保存，备用。
5、样品制备：参考Macintosh方法对牛奶中抗生素进行提取，即在5 ml牛奶中加入10m10.01 mol／LNaAc溶液进行稀释，注入Sep-Peakl8固相萃取处理后，再依次用3 m1水、3 ml三氯甲烷冲洗小柱并通气1 min，用1 ml甲醇溶液洗脱样品，所得样品溶液用氮气去除有机溶剂，残渣用200u1三氯甲烷溶液溶解，离心分离(14 000r／min)10min，取上清液进行分析。
二、结果与讨论
1、磷酸盐缓冲溶液浓度对分离的影响：用上述配制好的磷酸盐系列浓度(10、20、30、40、50 mmol／L)作为缓冲溶液进行分离样品，当浓度较小时，谱峰变宽，保留时间短；当浓度较大时，减弱了溶质间的相互作用，降低了样品扩散，使谱峰变得敏锐，相邻组分的分离度增大。高浓度的缓冲溶液还压缩了双电层，使电位减小，电渗流降低，从而迁移速度变小，保留时间增加。实验结果表明，选20mmol／L磷酸氢二钠-10 mmol／L柠檬酸缓冲液可获得较短的保留时间和较好的分离效果。
2、缓冲液pH值的影响：四环素类抗生素和氯霉素的等电点(P1)4-6，故它们在pH值2-8范围内较稳定。磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH缓冲范围为2.2-8.0，且磷酸盐和柠檬酸在短波长下光吸收低，不会增加基线噪音，降低了可检测浓度，因此选用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系来研究不同的pH值对抗生素分离效果的影响。随pH值的降低，毛细管表面的负电荷减少，电渗流减弱，实验结果显示毛细区带电泳激光诱导荧光法测定内毒素出峰时间相应延长(但在pH值为2.6时出峰时间反而缩短，这可能是因为此时pH值较低，抗生素带下电荷较多，运动较快的缘故，尽管此时电渗流较小)。同时实验结果还表明pH3.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为基本条件。
3、有机试剂的影响：电泳缓冲液中添加1种或几种有机试剂，对样品的溶解性、电渗流大小和分辨率等都有较大的影响。抗生素在磷酸氢二钠-柠檬酸电泳缓冲液中溶解性较差，因此需在电泳缓冲液中添加一定量的甲醇以解决溶解性差问题。结果表明其中添加体积分数为10％的甲醇效果最好。
4、SDS浓度对分离的影响：单独使用20mmol／L磷酸氢二钠-10 mmol／L柠檬酸作缓冲溶液，发现抗生素中有些被测组分重叠，因此我们选用MECC法。实验时，固定磷酸盐的浓度，改变SDS浓度为10、15、20、25、30 mmol／L，由实验结果看，SDS浓度太低，谱峰分不开；而SDS浓度太高时，基线不稳，噪声增大，保留时间长。因此我们选择SDS浓度为20 mmol／L。
5、标准曲线绘制：精密称取适量的抗生素对照品，制成不同浓度的标准溶液，以20 mmol／L磷酸氢二钠-10 mmol／LSDS溶液缓冲溶液(pH=3.2)，分离检测，以峰面积除以对应保留时间，得到校正峰面积r为纵坐标，样品质量浓度为X，单位是ug／L，绘制工作曲线，各种线性关系。
6、样品测定：将制得的样品试液在选定条件下，即20 mmol／L磷酸氢二钠-10 mmoL／L柠檬酸中含20mmol／LSDS溶液缓冲溶液，pH=3.4，工作电压20kV，高位真空进样5g，温度26℃，于264nm紫外检测，3个不同品牌牛奶样品中只检出了土霉素和氯霉素残留，其平均质量比分别为1.91ug／g和3.56mg／kg。抗生素标准品的毛细管电泳分离谱见.
7、添加回收率：在牛奶中加适量的抗生素对照品，按样品测定方法进行回收率实验。结果牛奶中四环素添加平均回收率为97.6％(n=5)，土霉素添加平均回收率为99.8％(n=5)，金霉素添加平均回收率为98．1％(n=5)和氯霉素添加平均回收率为96.2％(n=5)，且重复性良好。