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痕量氨基糖和中性单糖的高校毛细管电泳及液相色谱分析

来源:化验室
摘要:糖缀合物本身的紫外吸收很弱,对痕量糖的分析多采用衍生方法,使其有较强的紫外或荧光吸收以利于检测。有关测定微量糖的高校液相色谱(HPLC)衍生方法,近年陆续有报道,其中在提高衍生反应转化率、缩短反应时间、降低衍生反应温度以利于保持寡糖结果的完整性等方面,都还有待于进一步改进和提高。本文采用一种与单糖有高......

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1. 前言
   糖缀合物,尤其糖蛋白中的寡糖链在生命过程中参与蛋白的靶向、细胞识别及抗体--抗原相互作用等重要生理过程,对其结构和功能的研究成了继DNA和蛋白之后又一重要课题而倍受人们的重视。因从生物体中可获得用于结构研究的寡糖量甚微,故寻求高效分离和高灵敏度检测手段成为必然。 糖缀合物本身的紫外吸收很弱,对痕量糖的分析多采用衍生方法,使其有较强的紫外或荧光吸收以利于检测。有关测定微量糖的高校液相色谱(HPLC)衍生方法,近年陆续有报道,其中在提高衍生反应转化率、缩短反应时间、降低衍生反应温度以利于保持寡糖结果的完整性等方面,都还有待于进一步改进和提高。HPCE是近年发展起来的一种新型的分离分析技术。由于它具有快速分离、高校、所需样品量小等优点,已广泛用于多肽、蛋白、核酸等生命科学领域研究。近年应用HPCE进行糖的分析也有报道。本文采用一种与单糖有高反应活性的新型紫外、荧光衍生试剂芴甲氧羰基肼(FMOC-Hydrazine)和芴甲氧羰基氯(FMOC-CI)对包括葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)、木糖(Xyl)、乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、氨基葡萄糖(GlcN)和氨基半乳糖(GalN)的单糖进行衍生,利用HPCE和HPLC技术,研究了它们的分离条件、线性定量关系和单糖衍生物的检测极限,并将此方法用于糖蛋白糖的组分测定。
2. 实验部分
2.1
   仪器 SpectraPHORESIS 1000TM毛细管电泳仪(TSP公司产品),ALTEX Model 100A Slovent Metering System 日立635-10LC荧光检测器。
2.2
   试剂 标准单糖,胎球蛋白,转铁蛋白,均为Sigma公司产品。
2.3
   缓冲液的配制 称一定量的硼酸,用法NaOH将PH调至对应值。
2.4
   FMOC-肼的合成 参照文献,将约100毫克芴甲氧基氯容于30毫升乙腈中。在快速搅拌条件下,将上述溶液缓慢滴加到1毫升水合肼中,待反应30分钟后,将反应液在低于40OC条件下真空旋转蒸发除去未反应的肼和溶剂,得白色片状固体物。此产品纯度可以达98%。产物可直接用于制备衍生物试剂,也可经乙醇或乙腈重结晶,得白色片状晶体。
2.5
   中性单糖衍生反应 取10微升含1~20纳摩尔糖的乙醇溶液,加入100微升含0.1%乙醇溶液。混合后加入100微升含20~400纳摩尔芴甲氧羰肼的乙肼溶液。将带有螺旋帽的聚四氟乙烯反应瓶拧紧,在65OC水浴中反应6小时,衍生反应产物可直接进行色谱分析。
2.6
   氨基单糖衍生反应 取10微升含1~5纳摩尔氨基糖的水溶液,加入100微升0.2mol/L PH7.0的硼酸钠和100微升含有10~50纳摩尔FMOC-CL的乙腈溶液,摇荡后在室温下反应4分钟,衍生反应液直接进行分析。
2.7
   糖蛋白的水解 将样品溶解于20微升水中,加入等体积4mol/L三氟乙酸。将带有螺旋帽的聚四氟乙烯反应瓶拧紧,在沸水中反应6小时后,冷却并将反应液以氮气吹干,用于上述的衍生反应。
3. 结果与讨论

3.1 衍生反应
   FMOC肼与单糖的衍生反应如图6所示。FMOC与单糖的最佳衍生反应条件已有详细讨论。FMOC肼同目前最常用的伯氨基衍生试剂相比,前者衍生条件温和(65OC,4~6小时),生成不稳定产物席夫碱(Schiffbase),需经长达8小时(90OC)的还原反应才可生成稳定的可用于分析的叔氨衍生物,其结果会使糖链结构的完整性遭受破坏,因而也就影响了随后的结构研究。糖蛋白寡糖链中常见的GalNAc和乙酰氨基葡萄糖在蛋白质水解过程中均定量转化为相应的氨基糖。采用FMOC-CL作为衍生试剂,可快速在室温下完成氨基糖的定量衍生。上述两种衍生方法均可使被衍生糖带有相同的FMOC荧光基团,用相同的色谱分离条件和相同的荧光检测条件即可测定,并且过剩的荧光衍生试剂及水解产物在反相色谱中均在糖衍生物之后流出,不影响分离。在HPCE中,它们均在电渗流处出峰。如有必要,也可将衍生反应液用氮气吹干后,用少量水溶解,用戊烷萃取2~3次以除去过剩的衍生试剂,而在水相中的糖衍生物损失极少(低于1%)。
3.2 电泳条件的选择
   单糖衍生物在水中不带电荷,需与硼酸络合形成糖-硼酸根阴离子才可用于电泳分离。在电泳过程中,对分离有重要影响的因素为缓冲液的浓度、PH值以及电泳过程的温度。以常见的五种单糖考察上述因素对分离的影响,其结果如图1~3所示。从图1可以看出,随着硼酸缓冲液的浓度增大,所有糖衍生物的漂移时间也随之增大。其中乙酰氨基半乳糖、氨基半乳糖衍生物的相对漂移时间值基本保持恒定不变,而岩藻糖、葡萄糖和半乳糖衍生物的相对漂移时间值则随之相应增大,从而有利于改善分离。由图2可知,随PH值的增大,所测糖衍生物的漂移时间值也有所增长,且相临组分的相对漂移时间值也随之增大,从而有利于改善分离。但带PH10~11范围内,所测糖衍生物的漂移时间值的顺序有颠倒。尽管如此,高PH条件对葡萄糖、岩藻糖、半乳糖和氨基半乳糖衍生物分离还是有利的。图3表明在电泳过程中的温度对分离的影响不象PH和缓冲液浓度那样显著,且对不同糖衍生物的影响也不尽相同,但温度升高,有利于缩短分离时间。   上述实验表明,较高PH值和硼酸浓度更有利于糖基上相临羟基与硼酸根离子的络合反应,分别形成取向和分子量不同的配合体,从而达到完全分离的目的。综上所述,采用较高PH值的硼酸介质体系,单糖衍生物可获得较好分离。从分离效率、分离速度和仪器分离状态三方面考虑,选择的分离条件为:120mmol/L硼酸,PH10.2,温度22OC,电压20KV。若缓冲液浓度、PH值和温度过高,必然会造成较大的电泳电流,焦耳热加大,检测器噪音增高,降低了检测极限且不利于分离。图4显示出了FMOC糖腙在选定电泳条件下色谱分离结果。由图4可以看出,Glc, Fuc, Man, GlcN, GalHAc alN和Xyl于14分钟内在HPCE上便可获得完全分离,且GalN和GlcN可得到完全分离。
3.3 色谱条件的选择
   用Cosmosil C18柱进行了FMOC-糖腙分离实验,使用恒定组分流动相考察不同PH及不同流动相组成对糖衍生物分离的影响,其结果表明:最佳流动相组成为30%乙腈,PH6~7。图5给出了FMOC-糖腙的HPLC分离结果,在15分钟内,用C18柱可将单糖衍生物部分分离且异构体GalH和GlcN在此条件下不能分离。
3.4 灵敏度及线性关系
   FMOC肼激发和发射波长分别为270和320纳米,其最大紫外吸收为263纳米。当HPCE进样量为3纳升,在263纳米处紫外检测及HPLC以270纳米激发,320纳米荧光检测时,七种单糖的最小检测量(信噪比1:3时)如表1表示。从表1可以看出,HPCE-UV检测极限为几个到二十几个fmol,其最小检出量优于HPLC-荧光检出极限,这主要得宜于HPCE的低进样量和高分辨率。线性关系结果表明,上述单糖在10-6~10-4mol/L浓度范围线性关系良好,而在HPLC上,线性范围为10~100pmol。
3.5 糖蛋白寡糖链的单糖组成分析
   应用上述HPLC法测定了胎球蛋白和转铁蛋白中糖的组成,所得结果与文献相近。HPCE用于实际样品中单糖含量测定仍在进行之中。

作者: 2008-7-4
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