点击显示 收起
开口箭TupistrachinensisBak．系百合科(Liliaceae)铃兰族开口箭属植物。其原植物又名开喉箭、万年青，为多年生常绿草本，以其根状茎入药，作为药用又名岩七、竹根七、竹节参、竹根七、竹节七、牛尾七等。医学古籍记载，开口箭味甘微苦，性寒，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调等症。土家族民间用其漱口液治疗咽喉炎、扁桃体炎，疗效显著。我国开口箭属植物约占全世界的70％，分布于陕西、甘肃、湖北、四川、云南、贵州等省。主产于湖北三峡库区及神龙架林区，栽培面积大，产量高，资源十分丰富。
本实验室对神农架产开口箭TupistrachinensisBak．的生药学、化学成分和药理活性进行了研究，结果表明开口箭正丁醇提取物对Hela，K562，A2780a等具有很好的抑制作用，细胞毒活性好，抗炎活性也很好。也曾报道了“开口箭中甾体皂苷元的含量测定”。本文进一步探索建立了香草醛一冰醋酸一高氯酸一比色法测定开口箭中总皂苷含量的方法。
1材料与仪器
1．1材料开口箭根茎，采自湖北省神农架林区，其原植物标本于2002-07采自同一地区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为TupistrachinensisBak．，原植物及药材现保存于本实验室(编号TC200207SNJ)。总皂苷对照品，本实验室自开口箭分离纯化的皂苷单体3一O—b—D一吡喃葡萄糖基一(1-→2)-b—D一吡喃葡萄糖基一(1-→2)一b—D一吡喃葡萄糖基(25R)一5(6)一烯一呋甾一3b，22a，26一三羟基26一O—b—D一吡喃葡萄糖苷。含量>98％(HPLC测定)。其他试剂均为分析纯。
1．2仪器S3100紫外分光光度计(韩国Scinco公司)，BP211D型电子天平(德国Sartorius公司)。
2方法
2．1对照品、供试品溶液的制备
2．1．1对照品溶液的制备精密称取经干燥至恒重的开口箭总皂苷对照品0．0050g，加甲醇溶解定容至5ml，制成每毫升含1mg的溶液，作为对照品溶液。
2．1．2供试品溶液的制备精密称取开口箭粉末0．70g(60目筛，50℃干燥4h)置圆底烧瓶中，加入25ml70％乙醇溶液，浸泡过夜，60℃回流提取两次，2h／次，减压抽滤，滤液合并，置蒸馏烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压浓缩，除尽溶剂后，加少量甲醇溶解，定容至25ml，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2．2测定方法适量供试品溶液置干燥具塞试管，60℃水浴挥干溶剂后，精密加入0．2ml5％香草醛一冰醋酸溶液和0．8ml高氯酸，摇匀，置60℃恒温水浴加热20min，取出，立即置冰水浴中冷却15min，加入5ml冰醋酸，摇匀，同时做空白，于(458±2)nm波长处测定吸光度值。
2．3标准曲线的绘制与线性关系精密吸取对照品溶液0．10，O．15，0．20，O．25，0．30，0．35，0．40ml，分别加入干燥具塞试管中，60℃水浴挥干溶剂，依次加入O．2ml5％香草醛一冰醋酸溶液和0．8ml高氯酸，置60℃水浴加热20min，取出，立即置冰水浴中15min，停止反应，加入5m1冰醋酸，摇匀，于458nm处测定吸光度，同时做试剂空白。以吸光度为纵坐标，以对照品质量为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程W=0．0631+O．2835A，r=0．9997，对照品在0．10～0．40mg范围内线性关系良好。
3结果
3．1精密度及重现性实验精密吸取对照品溶液0．2ml，共6份，按“2．2”项下方法自60℃(2水浴挥干起测定(见表1)。其RSD为1．09％，表明方法精密度良好。精密称取样品粉末0．07g，共5份，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取0．05ml，显色测定(见表2)。其RSD为4．58％，表明方法重现性良好。
表1精密度实验结果
|
编号 吸光度 RSD 1 2 3 平均值 总平均值 （%） |
|
1 0．4954 0．4975 0．4933 0．4954 2 0．5101 0．5110 O．5089 O．5100 3 O．5054 0．5023 0．5045 0．5040 0．5012 1．09 4 0．4993 O．501O O．5003 O．5002 5 0．5023 O．504O 0．503O O．5031 6 0.4939 0.4953 0.4950 0.4947 |
表2重现性实验结果
|
编号 吸光度 样品原 RSD 1 2 3 平均值 测得值 （%） |
|
1 O．468 8 O．466 O 0．469 6 0．468l 2 0．421 0 0．419 3 0．425 9 0．422 1 3 0．457 0 0．453 6 0．450 5 0．453 7 O．444 7 4．58 4 0．440 2 O．436 9 O．438 4 O．438 5 5 0．425 7 0．420 3 0．422 3 0．422 8 |
3．2 显色溶液稳定性实验精密量取对照品溶液和供试品溶液适量，分别按标准曲线的制备方法显色后放置，于0，30，60，90，120 min测定吸收度值(见表3)。结果表明对照品和供试品在120 min内显色稳定。
3．3 加样回收率实验精密称取已知总皂苷含量的开口箭粉末，共5份，加入对照品适量，按照供试品溶液制备方法制备，显色测定。结果见表4，平均回收率为97．2％，RSD为2．26％。
表3 显色后溶液稳定性实验结果
|
样品 吸光度 平均值 RSD 0min 30min 60min 90min 120 min (%) |
|
对照品A O.4947 0.4723 0.4642 0.4625 0.4641 0.4716 2.85 供试品A 0.6890 O.662O 0.6555 O.6509 0.650O 0.6615 2.44 |
表4加样回收率实验结果
|
编 已知量 加入量 测得量 回收率 平均回收率 RSD 号 m／mg m／mg m／mg (％) (％) (％) |
|
1 71．2 100．4 166．2 96．8 2 67．2 100．2 168．7 100．8 3 69.7 99．7 162．3 94．8 97．2 2．26 4 67．6 101．1 163．9 97．2 5 65．4 100．9 160．5 96.5 |
3．4 样品含量测定精密吸取按供试品溶液0．05 ml，按“2．2”测定方法项下操作，同时做空白，计算供试品中总皂苷含量。结果见表5。结果表明开口箭70％乙醇提取物总皂苷含量为135．1 mg／g，其百分含量为13．51％，RSD为4．57％。
表5样品中总皂苷含量测定结果
|
编号 吸光度 总皂苷含量C／mg·g-1 总皂苷百分含量C／mg·g-1 RSD(%) |
|
l 0．467 0 139．6 13．96 2 0．420 5 130．2 13．20 3 0．442 3 134．7 13．47 4．57 4 O．460 9 138．4 13．84 5 0．427 6 131 7 13．17 平均 0．444 7 135．1 13．51 |
4讨论
经过对皂苷类含量测定文献的统计与分析，选定下列4种显色剂：0．2ml5％香草醛一冰醋酸溶液和0．8ml高氯酸、O．5ml8％香草醛乙醇溶液和5．0ml72％硫酸试液、高氯酸、0．2ml5％香草醛一冰醋酸溶液和0．8ml高氯酸；4种不同的显色温度：55，60，65，70℃；4种不同的显色时间：10，15，20，25min；通过实验进行比较。发现用0．2ml5％香草醛一冰醋酸和0．8ml高氯酸作显色剂，显色温度为60℃，显色时间为20min时，对照品溶液与供试品溶液在(458±2)nm波长处均有最大吸收。
对照品溶液依法显色后，溶液的波长(400～700nm)扫描图中，在458和554nm两处均出现最大吸收峰，但供试品溶液的最大吸收峰分别在456nm和580nm处，表明供试品溶液在580nm处的吸收峰有其它成分干扰，而在456nm处的吸收峰无其它成分干扰，吸收稳定。
供试品溶液制备时分别用水、甲醇、70％乙醇、95％乙醇作溶剂，进行比较，发现70％乙醇溶液浸泡开口箭粉末时其总皂苷溶出量最大。
建立了开口箭总皂苷含量测定方法，采用5％香草醛一冰醋酸溶液为发色体系的比色法测定开口箭中总皂苷的含量，显色后溶液在120min内稳定，标准曲线在0．10～0．40mg范围内线性关系良好，方法的精密度和重现性好，RSD分别为1．09％和4．58％；加样平均回收率为97．2％，RSD为2．26％；测得开口箭70％乙醇提取物中总皂苷平均含量为135．1mg／g，其平均百分含量为13．51％，RSD为4．57％，方法操作简便，精密度及准确度高，重现性及稳定性好，可用于开口箭药材的质量控制。