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【摘要】 以氢氧化钠水解合成鱼腥草素类药物，然后用乙醚提取，除去乙醚后，用HPLC法测定大鼠血样和组织样品中药物的含量。结果表明：碱水解后合成鱼腥草素，形成共轭双键的烯醇式烷酰乙醛，紫外吸收显著增强，HPLC图谱测定物峰分离良好。血液加样标准曲线回归线性良好，r=0.999以上，线性范围为0.1～100 mg/L，标准加入回收率为97.3％。利用该方法分析合成鱼腥草素类药物在动物血液、脑、肝、心脏、肾脏和肌肉等组织中的残留完全可行。
【关键词】 鱼腥草素同系物 水解 高效液相色谱 组织残留
1 引言
鱼腥草作为传统中药，其主要活性成分为鱼腥草素，化学名称为癸酰乙醛。鱼腥草素对金黄色葡萄球菌等多种病源菌有明显的抑制作用[1]。在医药上已广泛用于治疗葡萄球菌等的感染和免疫力低下等[2]。作为医药产品使用的是癸酰乙醛的亚硫酸盐（称为合成鱼腥草素）。以癸酰乙醛为前体模型化合物，合成了一系列活性更高的合成鱼腥草素类似物 [3]，其中的衍生物之一新鱼腥草素钠（十二酰乙醛亚硫酸钠）,已经投入批量生产。
合成鱼腥草素的疏水性较强，在水溶液中不稳定，鱼腥草素及其水解产物又无强的紫外吸收，高压液相分析检测的灵敏度不高，使HPLC法测定溶液中合成鱼腥草素含量的报道尚不多见[4]。而对于体内合成鱼腥草素类药物含量的测定尚未见报道。其原因主要是因为脂酰乙醛类药物的临床用量小，体内浓度不高，很难检测其在动物血液和组织中的微量存在。
本研究通过对样品进行碱水解后，用醚提取的预处理方法，建立了HPLC法定量分析大鼠血液和组织中微量脂酰乙醛类药物的方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
510型高效液相色谱仪(美国Waters公司)。辛酰乙醛亚硫酸钠（HOUC8）、癸酰乙醛亚硫酸钠（HOUC10）、十二酰乙醛亚硫酸钠（HOUC12），含量99%以上，均由西南大学药用资源化学研究所提供。甲醇、乙醚、氢氧化钠等试剂均为色谱纯和分析纯，水为二次蒸馏水。SD大鼠，体重227.8±13.5g，由重庆医科大学试验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK(渝)20020002。
2.2 实验方法
2.2.1 鱼腥草素的水解方法 在3支10 mL试管中分别加入1 mL 6 mg/L合成鱼腥草素（HOUC10）溶液，1 mL水，或1 mL 0.2 mol/L NaOH，或1 mL 0.2 mol/L HCl，混合均匀后室温放置30 min。然后进行HPLC分析。分析条件为：色谱柱为Hypersil C18(4.6 mm×25 mm)，流动相为甲醇水四丁基氢氧化铵（70∶30∶0.3，V／V），流速0.4 mＬ/min；柱温为30℃；进样量20 μＬ；检测波长为285 nm。
2.2.2 血液样品中HOUCn标准曲线的制定 从SD大鼠尾静脉采血，肝素钠抗凝。取10 mＬ试管54只，各加血样0.1 mＬ，分为3组，每个浓度重复３个；分别在每只试管中加入10、7、5、3、1.0和0.10 mg/L的HOUC8，HOUC10和HOUC120.1 mＬ，混合均匀后，加入5 mＬ二次蒸馏水，加塞，倒置混匀，静置15 min。再于每支试管中加入1 mol/L NaOH溶液0.2 mＬ，混匀，静置15 min。加2 mＬ 4℃乙醚，充分提取，以4000 r／min离心5 min，取上清液（乙醚层）0.3 mL，40℃水浴挥干。然后，样品分别加入含0.1 mol NaOH的流动相（见2.2.1），水浴超声处理5 min，静置30 min，在HPLC仪上分析。色谱条件与2.2.1相同。
2.2.3 大鼠体内的HOUCn血药浓度测定[5]和数据处理 给SD大鼠肌肉注射相同剂量（25 mg/kg）的癸酰乙醛亚硫酸盐，在不同的时间间隔从尾静脉采各大鼠血样。取血样0.1 mL于试管中，分别加入5 mL二次蒸馏水，加塞，倒置混匀，静置15 min。水解、萃取、分析等条件与2.2.2相同。
2.2.4 不同组织中残留的HOUCn的提取与含量测定 SD大鼠为实验大鼠。在大鼠肌肉注射脂酰乙醛亚硫酸盐（25 mg/kg），48 h后，分别取其脑、心脏、肝、肾和后腿肌肉组织，立即放入-40℃冰柜保存。分别准确称取－40℃冰柜保存的各种组织约0.5 g，加5 mL二次蒸馏水制成匀浆后，按2.2.2的方法提取，并进行测定。
图1 HOUCn在血液中的HPLC图谱（略）
Fig．1 HPLC spectra of houttuyfonate homologues (HOU)C10 in blood sample
1． 未水解（without hydrolysis）； 2． 碱水解（basic hydrolysis）； 3． 酸水解（acid hydrolysis）。
3 结果与讨论
3.1 脂酰乙醛亚硫酸盐水解条件的选择
在不同水解条件下，癸酰乙醛亚硫酸盐的HPLC图谱见图1。从图中可以看到，水溶液中的癸酰乙醛亚硫酸盐为2个峰。但是，吸收很弱，分离效果差(曲线1)。在酸性条件下，癸酰乙醛亚硫酸盐的吸收峰有3个，有1个峰分离较好，但均较弱(曲线3)；在碱性条件下，癸酰乙醛亚硫酸盐有3个峰，其中有1个是分离良好的强吸收峰(曲线2)。
烷酰乙醛为β二羰基类化合物，分子中含有一个羰基和一个醛基。当其与亚硫酸氢钠加成成为烷酰乙醛亚硫酸钠后，结构变为含一个羰基和一个羟基，其紫外和可见光吸收很低。烷酰乙醛亚硫酸钠在水中不稳定，在酸、碱和加热等条件下会发生水解和分解[6]（R代表烷烃基）。
鱼腥草素钠盐在水中水解反应:
ＲＣＯＣＨ２ＣＨＯＨＳＯ３ＮaⅠＨ２OＲＣＯＣＨ２ＣＨＯⅡ＋NaHSO3反应1
鱼腥草素钠盐在酸水中的水解反应:
ＲＣＯＣＨ２ＣＨＯＨＳＯ３ＮaⅠＨ２OH+ＲＣＯＣＨ２ＣＨＯⅡ＋Na++SO2↑＋Ｈ２Ｏ
ＲＣＯＣＨ２ＣＨＯⅡΔＲＣＯＣＨ３Ⅲ＋ＣＯ↑反应２
鱼腥草素钠盐在碱水中的水解反应:
ＲＣＯＣＨ２ＣＨＯＨＳＯ３ＮaⅠＨ２OH－ＲＣＯＣＨ２ＣＨＯⅡ＋Na２SO３＋Ｈ２Ｏ
ＲＣＯＣＨ２ＣＨⅡＨ２OＯＨ－ＲＣＯＣＨ２ＣＨＯＨⅣ反应３
本类药物在水溶液中（反应1），以烷酰乙醛亚硫酸钠（Ⅰ）和烷酰乙醛（Ⅱ）两种形态混合存在，导致出现两个吸收峰。从结构上看，由于两个双键没有共轭，它们的紫外吸收都很低。在酸性条件下（反应2），本类药物将首先水解然后分解为甲基烷酮（Ⅲ），存在的形态就更复杂。由于水解的条件难以控制，最终产物也比较复杂；但是，无论那种产物，其紫外吸收均较弱。在碱性条件下（反应3），烷酰乙醛亚硫酸钠将首先水解成烷酰乙醛（Ⅱ），然后烷酰乙醛异构化成烯醇式结构（Ⅳ）；烯醇式结构形成共扼双键，紫外吸收显著增强。HPLC图谱表明，碱性环境的脂酰乙醛亚硫酸钠水解后，测定物峰分离较好，其峰面积增加了10 倍以上，而且其峰的保留值也发生了变化，保留值的改变也说明待测成分发生了结构变化。
图2 HOUCn在285 nm峰面积与浓度的关系（略）
因此，图1中曲线2的主峰（a）是水解后的产物，即烯醇式烷酰乙醛（Ⅳ）。可见，选择碱性条件下对烷酰乙醛亚硫酸盐进行水解，不仅可以大幅度提高产物的吸光度，而且水解的产物比较单一，能够有效提高分析的灵敏度和稳定性。因此，本研究选择对烷酰乙醛亚硫酸盐进行碱性水解。
3.2 血液中烷酰乙醛亚硫酸盐浓度的测定结果
按2.2.2的方法测得的烷酰乙醛亚硫酸盐的结果见图2。从图2 中可以看到，在0.1～100 mg/L浓度范围内，辛酰乙醛亚硫酸钠、癸酰乙醛亚硫酸钠和十二酰乙醛亚硫酸钠均具有良好的线性。以峰面积（Sa）对浓度（C）进行回归得方程：
HOUC8的回归方程为C=4.12×10-5X-1.93， r=0.9997（1）
HOUＣ10的回归方程为C=8.56×10-5X-0.37， r=0.9999（2）
HOUＣ12的回归方程为C=3.84×10-6X-1.29， r=0.9993（3）
线性范围为0.１～１００ mg/L。
如果不经过萃取，直接进行液相分析，由于血液中含有大量蛋白质、色素、脂酯及非常复杂其它成分，对HPLC的分析图谱影响非常大。经过萃取分离后，样品的纯度大大提高，图谱的效果显著改善。
图3 HOUC10血药浓度随时间的变化（略）
通过加标回收法，测得样品平均回收率97.3％; RSD为0.82％(n=8)。可见上述分析方法是完全可行的，在0.1～10０ mg/L之间有良好的线性相关性。
3.3 脂酰乙醛亚硫酸钠在大鼠体内的处置状况
经2.2.3的处理和分析表明：SD大鼠注射癸酰乙醛亚硫酸钠溶液后，在不同时间采取的血样经本方法测定的血药浓度与时间呈抛物线关系（见图3）。癸酰乙醛亚硫酸钠在大鼠体内呈相对均匀分布的一级吸收一室模型，数学表达式为： C=80.718(e-0.117t－e-2.428t)。肌肉注射后达峰时间短（1.311 h）,吸收迅速，血药浓度高，半衰期（5.907 h）与每日2次的临床给药方案相适应[7]。
表1 HOUCn在不同组织中的残留量 (mg/kg)（略）
3.4 组织残留药物
表1表明，在对大鼠给药48 h后脂酰乙醛类药物在脑、心脏、肝和肾脏等组织内均有可测定的残留，肌肉组织的残留已在检出限以下。脑组织中的残留量有随药物脂肪链碳原子数增加而增加的趋势，这可能与碳原子数增加，药物的极性减小，穿透脂肪组织的量增加有关, 心脏、肝和肾脏等组织的残留则差异很小。
【参考文献】
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4 Li Zhanming(李湛明), Yang Liwei(杨立伟)，Yang Cuiping(杨翠平). Journal of Chinese Medicinal Materials(中药材), 2001, 24(8): 596
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