同时检测动物肌肉中26种β2兴奋剂和激素残留

　　【摘要】  　　建立了动物肌肉中10种β2兴奋剂、16种激素共26种促蛋白合成剂的固相萃取样品前处理方法，用同位素内标结合气相色谱质谱联用法进行分析。动物肌肉经过β葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，酶解液通过SLW固相萃取柱浓缩净化，先用甲醇洗脱16种激素，然后用5%氨化乙酸乙酯洗脱10种β2兴奋剂，后者经过双三甲基硅基三氟乙酰胺+1%（φ）三甲基氯硅烷衍生后，用GC/MS测定β2兴奋剂；前者再用SLH固相萃取柱净化，七氟丁酸酐衍生后用GC/MS测定激素。结果表明, SLW固相萃取柱能够很好地分离动物肌肉酶解液中10种β2兴奋剂、16种激素,结合GC/MS测定，本方法检出浓度为0.5～1.0 μg/kg，回收率在68. 2%～10３.2%之间，相对标准偏差1.５%～12.4%。

　　【关键词】  促蛋白合成剂 β2 兴奋剂 激素 多种残留 气相色谱 质谱

　　MultiＲesidue Ａnalysis of 26 Types of β2Ａgonists and　Ｓteroids in Ａnimal Ｔissues

　　WＵ PingＧu, WＡＮＧ Qiang, CＨＥＮ HuiＨua, YＩＮＧ YongＦei， ZＨＡＯ YongＸin，SＨＥＮ XiangＨong， SＯＮＧ GuoＬiang, XＵ XiaoＭin

　　1（Zhejiang Provincial Center For Disease Control and Prevention, Hangzhou 310009）

　　2(Zhejiang Provincial Agricultural Scientific Academy, Hangzhou 310020)

　　3(Zhejiang Provincial Inspection Center for Animal Products Quality, Hangzhou 310020)

　　Abstract   A sample pretreatment method has been developed for the multiresidue analysis of 26 types anabolic agents including 10 types agonists and 16 types steroids in animal tissues by gas chromatographymass spectrometry, based on isotopelabeled internal standards and solid phase extraction. The homogenized animal muscle was hydrolyzed by βglucuronidase /arylsulfatase, then passed through SLW solid phase extraction column. The steroid fraction was obtained by eluting the column with methanol and the agonist fraction was eluted with 5% ammonia in ethyl acetate. The agonist fraction was derivatized with bis(trimethylsily1)trifluoroacetamide+1％(m/V) trimethylchlorosilane． The steroid fraction was further cleanuped on a SLH cartridge and the purified residue was derivatized with heptafluorobutyrate. Both fractions were analyzed by gas chromatographymass spectrometry. The experimental results indicated that the 10 types β2agonists and 16 types steroids could be separated using SLW solid phase extraction column. The detection limits were 0.5－1.0 μg/kg, the rates of recovery were 68.2%－103.2%, and the relative standard deviations were 1.5%－12.4%.

　　Keywords   Anabolic agents, β2agonists, steroids, multiresidue, gas chromatographymass spectrometry

　　本文系浙江省卫生厅优秀青年人才基金（No.2006QN007）、浙江省重点科研农业基金（No.2005C22029）和浙江省重大科技攻关基金（No．2005C12007）资助项目* Email: pgwu@cdc.zj.cn

　　1 引 言

　　畜产品生产过程滥用促蛋白合成剂（主要有激素、β2兴奋剂）对食品安全、生态环境造成直接及潜在的危害。20世纪80年代以来许多国家或组织通过立法来限制或禁止在食用动物养殖中使用促蛋白合成剂。我国也禁止将促蛋白合成剂用于动物促生长目的。由于利益驱动，在世界范围内激素和β2兴奋剂仍被大量滥用。

　　国内外对动物肌肉中激素、β2兴奋剂多残留确认检测技术文献报道很多，主要有气相色谱质谱法(GC/MS)[1～8]、液相色谱质谱法(LC/MS)[9～12]，但所采用的方法很少涉及上述两大类药物多残留的同时检测。动物性食品中兽药残留由于残留物水平很低，样品基质复杂，干扰物质多，要尽可能除去与目标物同时存在的杂质，减少色谱干扰峰，避免检测器和色谱柱污染，因此样品预处理约占工作量的70%，样品的分离纯化是兽药残留分析中费时和费力的步骤，多类兽药残留集成化检测技术和兽药提取净化技术是今后研究的热点，固相萃取技术、同位素稀释技术近年来在复杂样品药物残留检测中得到广泛应用[1～12]。

　　本研究考虑到动物肌肉中激素、β2兴奋剂检测均需要先用β葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶酶解，因此考虑两大类药物残留的同时检测。本研究采用SLW混合型固相萃取柱作为动物肌肉中促蛋白合成剂多残留测定前处理技术，先将上述两类药物在SLW柱上富集后分别洗脱，然后用GC/MS分别测定26种促蛋白合成剂(10种β2兴奋剂、16种激素)残留，结合同位素内标进行定量分析。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　6890 GC5973MS气相色谱/质谱仪（美国Agilent公司）;匀质机;超声清洗器;旋涡混匀器。特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚、甲基睾丸酮、炔诺酮、炔雌醇、炔诺孕酮、睾丸酮、雌二醇、雌三醇、雌酮、黄体酮、丙酸睾酮、醋酸甲地孕酮、戊酸雌二醇、醋酸甲羟孕酮标准品（纯度大于98%, Sigma公司）；马布特罗、卡布特罗、西马特罗、克仑潘特、苯氧丙酚胺、班布特罗、莱克多巴胺标准品（100 mg/L，加拿大Palaloger博士惠赠）； D9克伦特罗、D3沙丁胺醇、D5莱克多巴胺、D8已烯雌酚、D8黄体酮、D4雌二醇（100 mg/L）储备液购自Cambridge Isotope Lab; β葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶购自Sigma；甲醇、乙酸乙酯为色谱纯；HCl、正己烷、氨水、无水硫酸钠、醋酸、醋酸钠等均为分析纯；七氟丁酸酐（ACROS公司）；双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA） +1%（m/V）三甲基氯硅烷（TMCS）（迪马公司）；SLH、SLW固相萃取柱规格为500 mg/6 mL（杭州福裕科技服务有限公司）。

　　2.2 标准溶液及试剂制备

　　（1）β2兴奋剂标准储备溶液   分别称取各种β2兴奋剂标准品10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在－18 ℃冰箱中备用；β2兴奋剂混合标准使用液用甲醇稀释至0.1 mg/L。（2）激素类标准储备溶液   分别称取各种同化激素10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在－18 ℃冰箱中备用，激素类混合标准使用液用甲醇稀释至0.1  mg/L。（3）D9克伦特罗、D3沙丁胺醇、D5莱克多巴胺（1.0 mg/L）β2兴奋剂内标混合液   使用时用甲醇稀释储备液至1.0 mg/L混合液。（4）D8已烯雌酚、D8黄体酮、D4雌二醇（1.0 mg/L）激素内标混合液   使用时用甲醇稀释储备液至1.0 mg/L混合液。（5）5%氨化乙酸乙酯   取0.5 mL浓氨水加9.5 mL乙酸乙酯，置于旋涡混匀器混匀，现配现用。

　　2.3  样品处理

　　2.3.1 样品的酶解和净化

　　称取5.0 g经绞碎均匀的动物肌肉于50 mL离心管中,分别加50 μL 1.0 mg/L β2兴奋剂、激素内标混合液，静置10 min，加入15 mL pH 5.2醋酸缓冲液，用匀质机匀质20 s，加入50 μL β葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶液，在37 ℃水浴中水解16 h后取出冷却，以10000 r/min离心10 min，分出上层溶液，用2.0 mol/L HCl调节至2.0±0.1，再以10000 r/min离心10 min，取上清液待用。

　　取SLW固相萃取柱，先用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL 50 mmol/L HCl活化柱子, 然后将前述的上层清液全部加到柱子上过柱, 再用5 mL水淋洗除杂质，真空泵抽干5 min。用5 mL甲醇洗脱收集组分1，再用10 mL 5%氨化乙酸乙酯洗脱收集组分2，各组分分别在50 ℃水浴中氮气吹干。

　　取SLH固相萃取柱，先用甲醇5 mL、正己烷5 mL活化柱子，用1 mL 3%乙酸乙酯/正己烷超声溶解上述组分1，然后加样到SLH柱上，待样品过柱后，用5 mL 3%乙酸乙酯/正己烷淋洗除杂质，再用10 mL乙酸乙酯洗脱收集组分3，组分3在50 ℃水浴中氮气吹干。

　　2.3.2 样品衍生

　　组分2蒸发剩余物加0.1 mL BSTFA+1% TMCS（m/V），在80 ℃的烘箱中加热衍生1. 0 h；同时取200 μL β2兴奋剂混合标准使用液，加50 μL 1.0 mg/L β2兴奋剂内标，氮气吹干，同时进行衍生化，衍生后氮气吹干，各加0.2 mL甲苯溶解，取1.0 μL甲苯溶液进行GCMS分析。

　　组分3蒸发剩余物加100 μL丙酮、50 μL七氟丁酸酐，在60 ℃烘箱中加热衍生1.0 h；另外分别取200 μL激素类混合标准使用液，加50 μL激素内标使用液，氮气吹干后与样品同时进行衍生化，衍生后氮气吹干，各加0.2 mL正己烷溶解，取1.0 μL正己烷溶液进行GCMS分析。

　　2.４ 色质谱条件

　　HP5 MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度280 ℃;柱温程序：初温120 ℃（3 min）10 ℃／min280 ℃（5 min） ； 载气为高纯氦气（99.999%），流速0.9 mL/min，不分流进样。EI离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；接口温度280 ℃；电子倍增器电压1506 V ；溶剂延迟：10 min。

　　3  结果与讨论

　　3.1 样品酶解、净化

　　动物肌肉中激素、β2兴奋剂残留都以游离或轭合物两种形式存在，仅检测游离部分可以不用酶解，检测轭合物或者总量时都需要用蛋白酶、β葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶水解后测定，本研究先用β葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶水解释放激素、β2兴奋剂轭合物再进行同时测定。采用具有反相和阳离子交换作用的SLW固相萃取柱，莱克多巴胺+莱克多巴胺（D5ractopamine+ ractopamine）。分别用甲醇、5%氨化乙酸乙酯洗脱获得组分1和组分2，两者分别含有激素和β2兴奋剂，组分1还含有较多杂质，再用正相SLH柱净化获得组分3，经过七氟丁酸酐衍生后测定激素残留，组分2经过 BSTFA+1%（m/V）TMCS衍生后测定β2兴奋剂残留。

　　3.2  样品测定

　　3.2.1 β2兴奋剂类药物残留测定

　　本研究同时测定β2兴奋剂和激素残留，样品酶解后水解液用SLW固相萃取柱净化,利用其阳离子交换性质富集、净化动物肌肉中β2兴奋剂残留，用10 mL 5%氨化乙酸乙酯洗脱SLW固相萃取柱获得β2兴奋剂组分2。10种β2兴奋剂及内标标准经硅烷化衍生后测定总离子流图见图1，具体的监测离子参考文献[6]，动物肌肉空白与加标总离子流图见图2。

　　由图2可知，10种β2兴奋剂经过酶解、SLW净化后完全可以满足实验要求。从总离子流图上看，与其它阳离子交换固相萃取柱如MCX、SLS[6]比较，除了莱克多巴胺处基线有所升高外，其它β2兴奋剂均无明显区别，这说明混合型SLW固相萃取柱阳离子交换功能完全可以用于样品β2兴奋剂净化，且其反相吸附功能对样品净化无干扰。

　　3.2.2 β2兴奋剂检测方法检出限、回收率及精密度

　　用本方法对动物组织进行10种β2兴奋剂标准加入回收实验，各化合物添加水平如表1，每个水平重复测量5次。实验结果见表1。由表1可知，在2. 0 μg/kg添加水平，上述10种β2兴奋剂的平均回收率为75.4％～89.6％ ，相对标准偏差为5.2％～12.2％ ；在4.0 μg/kg的添加水平，平均回收率范围为80.5％～98.5％ ，相对标准偏差2.7％～8.2％；在8.0 μg/kg的添加水平，平均回收率范围为85.3％～108.2％ ，相对标准偏差1.3％～7.8％；按照信噪比S/N=3：1计算本方法β2兴奋剂类药物残留的检出限为0.5～1.0 μg/kg之间。

　　3.2.3  激素类药物气相色谱质谱分析

　　GC/MS法测定动物肌肉中激素残留，一般需要先进行硅烷化或者酰化衍生，以提高检测灵敏度，前者衍生试剂主要有BSTFA、MSTFA+TMSI+DTE等[5，13～15]，后者主要有七氟丁酸酐[13，17]。本研究比较了上述3种硅烷化和酰化衍生试剂对下列16种同化激素的衍生效果，发现硅烷化试剂不能对醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮进行衍生化，使这两者激素在测定中灵敏度达不到检测要求，然而这两种激素是我国明文规定在动物养殖过程禁止使用的具有雌激素样作用的物质，因此硅烷化衍生不适合本文16种同化激素的测定；此外，七氟丁酸酐衍生后能够产生较高峰度的特征性高质量数分子离子峰，且碎片信息较多，干扰少，16种同化激素及内标七氟丁酸酐衍生后测定结果见表2。通过对柱温、载气流速的优化，除了己烷雌酚、双烯雌酚、双烯雌酚以及响应的同位素内标不能较好分离外，其它激素均能够完全分离，激素及内标标准经七氟丁酸酐衍生后测定总离子流图见图3,根据上述激素全扫描质谱图以及实际样品检测过程离子的干扰情况，确定监测离子,保留时间及特征离子见表2。表1  10种β2兴奋剂方法检出限、回收率及精密度（略）表2  七氟丁酸酐衍生特征离子和保留时间（略）

　　3.2.4  激素类药物多残留测定

　　本方法利用SLW柱用固相萃取的反相吸附功能富集酶解液中激素组分，然后用正相SLH固相萃取柱对甲醇洗脱物组分1进一步净化，SLH固相萃取柱先用5 mＬ 3%乙酸乙酯/正己烷淋洗除去组分1中部分杂质，而16种激素被SLH固相萃取柱保留，再用10 mＬ乙酸乙酯洗脱收集激素组分3进行检测，其除杂效果、回收情况均可以满足实验要求，结果见表2，动物肌肉空白与加标总离子流图见图4，标准加入回收实验的结果见表3。由表3可知，在2.0 μg/kg添加水平，上述１6种激素的平均回收率为68.2％～85.3％，相对标准偏差为4.2％～12.4％ ；在5.0μg/kg的添加水平，平均回收率范围为78.3％～95.8％，相对标准偏差2.8％～9.3％；在10.0μg/kg的添加水平，平均回收率范围为86.3％～103.2％ ，相对标准偏差1.5％～6.5％；该方法对动物肌肉中的定量检测限范围为0.5～1.0 μg/kg。表3   16种激素的检出限、回收率及精密度（略）

　　结果表明，本方法用SLW混合性固相萃取柱同时分离、净化动物肌肉酶解液中β2兴奋剂、激素，然后用同位素内标结合气相色谱质谱联用法（GC/MS）进行分析10种β2兴奋剂、16种激素残留，方法检出限、回收率、精密度均达到国内外技术法规要求，能满足实际样品的检测的要求。

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