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摘要 建立了牛奶中四环素、金霉素、土霉素、强力霉素、去甲基金霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素等7种四环素类抗生素及差向四环素、差向金霉素、差向土霉素等3种代谢产物多残留的液相色谱串联质谱同时测定方法。方法采用Inertsil C83（5 μm，150 mm×2.1 mm i.d）反相色谱柱，以pH 4.0的EDTAMcllvaine 缓冲溶液为提取溶液，以HLB固相萃取柱为净化柱，流动相为甲醇+0.01 mol/L三氟乙酸（梯度洗脱），流速0.3 mL/min，以正离子多反应监测模式测定，进样量30 μL。方法的检出限为0.5～10 μg/kg；测出限为50 μg/kg；线性范围为50~1200 μg/L，加标回收率为74.4％~101％，相对标准偏差为1.8%~8.3%。本方法具有灵敏、准确、简便、快速等优点，适用于牛奶中四环素类抗生素及其代谢产物多残留的同时确证检测。
关键词 高效液相色谱串联质谱，四环素类，代谢产物，残留，牛奶
1 引言
四环素类（tetracyclines, TCs）为广谱抗菌药,被广泛用作药物添加剂，用于预防和治疗畜禽疾病。但由于该类药物的使用不合理及滥用，容易诱导耐药菌株和导致在食品及牛奶中四环素类药物的残留问题。欧盟及我国均规定牛奶中四环素类抗生素的最大残留限量为0.1 mg/ kg[1]。常用的TCs有：四环素（tetracycline, TC）、金霉素（chlortetracycline, CTC）、土霉素（oxytetracycline, OTC）、强力霉素（doxycycline, DC）、去甲基金霉素（demeclocycline, DMCTC）、甲烯土霉素（methacycline, MTC）和二甲胺四环素（minocycline, MINO）等。另外，四环素、金霉素和土霉素还可在动物体内经代谢而转化为差向四环素（4Epitetracycline, ETC）、差向金霉素（4epichlortetracycline, ECTC）和差向土霉素（4epioxytetracycline, EOTC），差向四环素类药物的药效极低或消失，但它们的毒副作用增加，已经被欧盟确定为四环素、金霉素和土霉素的残留标识物[1]。
图1 四环素类抗生素的分子结构（略）
目前，TCs残留的测定方法主要有微生物法[1]、酶联免疫法[2]、薄层色谱法[3]和液相色谱法[4～1０]，但这些方法存在特异性差的缺点。液质联用法由于具有特异性强和灵敏度高的特点，可用于四环素类抗生素残留的确证分析。但当前国内外对四环素类多残留的液质联用检测方法的报道较少[1１]，未见关于同时检测四环素类抗生素及其代谢产物残留的文献报道。而国外已开始四环素类抗生素代谢产物残留检测方法的研究[1２～1４]。
本研究建立了牛奶样品中10种四环素类多残留的高效液相色谱/串联质谱确证方法，填补了国内外的技术空白，可为牛奶样品中四环素类药物及其代谢产物残留的监督检验和残留监控提供技术支持。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
API3000型串联质谱仪，配Agilent 1100型高效液相色谱仪和电喷雾离子源；Minishaker MS1型旋涡混合器；UNIVERSAL 32R型低温离心机； ZYMARK LV型吹氮浓缩仪；固相萃取真空装置（Agilent公司产），20孔；伏特pH 510型pH计；Oasis HLB固相萃取柱等。二甲胺四环素盐酸盐(Sigma公司，纯度91%)、土霉素.2H2O (Sigma公司，纯度99%)、四环素(Sigma公司，纯度95%)、去甲基金霉素盐酸盐(Fluka公司，纯度99%)、金霉素盐酸盐(Sigma公司，纯度80%)、甲烯土霉素盐酸盐(Riedelde Haen 公司，纯度99.4%)和强力霉素盐酸盐(Fluka公司，纯度98%)、差向四环素（Acros公司，纯度100％）、差向土霉素（Acros公司，纯度97％）、差向金霉素（Acros公司，纯度97％）；甲醇、乙腈和三氟乙酸为色谱纯试剂；其它试剂均为分析纯试剂；水为高纯水。0.1 mol/L EDTAMcllvaine 缓冲溶液：称取柠檬酸（含1个结晶水） 12.9 g，Na2HPO4 10.9 g，EDTANa2 37.2 g，用高纯水溶解并定容至1L，调节pH值至4.0±0.05。牛奶为市购。
2.2 仪器条件
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil C83，5 μm，150 mm×2.1 mm i.d.；流速：0.3 mL/min；柱温：30℃；进样量：30 μL。流动相：甲醇 (A)0.01 mol/L三氟乙酸 (B)，洗脱梯度为：0 min (5.0％A)→5.0 min (30.0％A)→10.0 min (33.5%A)→12.0 min (65.0%A)→17.5 min (65.0%A)→18.0 min (5.0％A)→25.0 min (5.0％A)，共25 min。
2.2.2 质谱条件 离子化模式：ESI+；质谱分辨率：单位分辨率；雾化气（NEB）：6.0 L/min；气帘气（CUR）：10.0 L/min；喷雾电压（IS）：4500 V；去溶剂温度（TEM）500℃；去溶剂气流700 L/min；碰撞气（CAD）6.0 L/min（Ｎ２）。其它条件见表1。
表1 四环素类兽药残留的保留时间和优化质谱条件（略）
2.3 样品前处理
称取混匀试样5 g（精确至０.０１ g），置于50 mL比色管中，用0.1 mol/L EDTAMcllvaine 缓冲溶液溶解并定容至50 mL，旋涡混合1 min，低温超声10 mins, 转移至50 mL聚丙烯离心管中，冷却至4℃，以5000 r/min离心10 min（温度低于15℃），过滤。准确吸取10 mL提取液以1滴/秒的速度过Waters Oasis HLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇水（5∶95,V/V）淋洗，弃去全部流出液。减压抽干5 min，最后用10 mL甲醇乙酸乙酯（10∶90, V/V）洗脱。将洗脱液吹氮浓缩至干（温度低于40℃），用1.0 mL流动相溶解残渣，低温超声5 min，0.45 μm滤膜过滤，供高效液相色谱/串联质谱仪测定。
3 结果与讨论
3.1 色谱分离条件的优化
根据文献[6]，选择Inertsil C8柱作为分离柱对10种四环素类化合物进行分离条件优化。电喷雾离子源的最佳流速范围为0.2~0.4 mL/min。本研究采用0.3 mL/min的流速，可保持较低的柱压，有利于色谱柱的长期使用。以甲醇乙腈0.01 mol/L的三氟乙酸水溶液为流动相对流动相的比例和洗脱梯度进行优化，结果发现在乙腈与甲醇共同存在的条件下，土霉素、差向土霉素和四环素３个组分的重构离子色谱峰始终存在交叉重叠，无法实现定量；有机相仅采用乙腈，土霉素与差向土霉素合为一个峰，无法实现土霉素与差向土霉素的准确定性和定量；有机相仅采用甲醇，经优化，可实现土霉素与差向土霉素的色谱分离。因此，有机相仅采用甲醇，经反复优化，采用2.2.1所示的流动相组成和洗脱梯度可达到较好的分离效果（见图2）。
图2 10种四环素类抗生素标准溶液的重构离子色谱图(100 μg/L)（略）
3.2 质谱测定条件的优化
首先采用1 mg/L的四环素、金霉素、土霉素、强力霉素、去甲基金霉素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、差向四环素、差向金霉素、差向土霉素标准溶液分别以流动注射的方式在正离子模式下进行母离子全扫描，确定各种四环素类抗生素的分子离子，然后分别以各种四环素类抗生素的分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，在本研究的质谱条件下，各种四环素类抗生素主要产生表2所示的子离子。选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性离子（见表1）。最后以多反应监测（MRM）正离子模式优化去簇电压（DP）、聚焦电压（FP）、射入电压（EP）、碰撞电压（CE）、碰撞室射出电压（CXP）、雾化气（NEB）、气帘气（CUR）、碰撞气（CAD）、喷雾电压（IS）、离子化温度（TEM）等质谱参数。四环素类抗生素的优化质谱条件见表1。
3.3 提取与净化条件的优化
由于四环素类抗生素的代谢产物差向四环素、差向土霉素、差向金霉素与四环素、土霉素、金霉素的分子结构和化学性质非常类似，因此四环素类抗生素及其代谢产物的提取与净化条件可采用与四环素类抗生素完全相同的提取与净化条件[7]。
3.4 方法的线性范围与检出限、定量低限
逐级稀释标准混合工作液进行液质联用分析，测定结果用Microsoft Excel软件回归，线性范围为：50～1200 μg/kg，检出限为0.5~10.0 μg/kg，测定低限为50 μg/kg。回归方程、相关系数、检出限见表3(y为峰面积，x为四环素类药物的浓度，μg/kg)。
表2 四环素类抗生素的分子离子与主要子离子（略）
表3 四环素类抗生素的回归方程、相关系数及检出限（略）
3.5 方法的回收率与精密度
选用不含10种待测组分的牛奶样品，分别加入50、100和200 μg/kg 3个浓度水平的10种四环素混合标准溶液，按2.3处理样品，分析并测定其精密度及回收率，测得平均回收率( n=10)在74.4%~101%之间，相对标准偏差在1.8%~8.3%之间。均满足国内外对残留分析的要求，表明该方法准确可靠。
3.6 实际样品分析
应用本方法检测进出口消毒奶和鲜奶样品共117批，结果四环素类抗生素超标样品5批次，其它均合格，合格率为95.7%。本方法具有灵敏高、选择性强、简便、快速等优点，测定低限为50 μg/kg，达到目前国际上检测四环素类抗生素残留的领先水平。可用于牛奶样品中四环素类抗生素及其代谢产物多残留的同时确证检测。
参考文献
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本文系科技部“十五”食品安全重大专项课题资助项目（No.2001BA804A18１２）
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（中国检验检疫科学研究院检测新技术与装备研究所，北京 100025)