用两种高效液相色谱法测定连翘中连翘苷的含量

    摘要采用两种高效液相色谱法测定连翘中连翘苷的含量.方法1采用键合氨基柱，氯仿-甲醇(体积比8∶1)为流动相，平均回收率为97.4%，RSD1.06%.方法2采用ODS-C18柱，以乙腈-水(体积比25∶75)为流动相，平均回收率为101.0%，RSD1.68%.

　　连翘为木犀科连翘属植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl.的干燥果实，具有清热解毒，消肿散结的功效，为1995年版《中国药典》收载的常用中药材之一，但没有收载有关成分的含量测定法。国内外文献中，早期以齐墩果酸和芦丁为指标成分，采用双波长扫描紫外分光光度法进行含量测定。梁文藻等人以连翘酯苷为指标成分，采用同样方法进行含量测定。前者专属性较差，后者误差较大.作者选择连翘苷作为指标成分，分别采用两种高效液相色谱法，对11批连翘药材进行了含量测定，为控制连翘的质量提供了科学的依据。

　　1、正相高效液相色谱法

　　1.1 仪器与试药

　　高效液相色谱仪：美国PerkinElmer公司1022-LC色谱工作站、LC295UV-VIS检测器；溶剂过滤器(大连化物所)；超声振荡仪(江苏昆山淀山湖检测仪器厂)；样品过滤器(大连化物所)；微量进样器(美国HAMILTON公司)；试剂：氯仿、甲醇(分析纯，沈阳化学试剂厂)、甲醇(色谱纯，中国医学科学院天津协和公司)；连翘苷(自制)；连翘药材：

　　1.2 色谱条件

　　1.2.1 紫外检测波长的选择

　  连翘苷在277nm处有最大吸收，因此选择277nm作为检测波长.

　　1.2.2 测试条件

　　色谱柱：SpherisorbNH2柱(大连化物所，4.6mm×25cm，10μm)；流动相：氯仿∶甲醇(8∶1)；检测波长：277nm；柱温：27℃；流速：1mL/min；进样量：20μL；灵敏度：0.02AUFS；纸速：3mm/min.

　　1.3 方法与结果

　　1.3.1 工作曲线的考察

　　精密称取连翘苷对照品2.006mg，置于10mL容量瓶中，用氯仿-甲醇(体积比6∶4)溶液溶解，稀释至刻度，作为对照品储备液.分别精密吸取该溶液0.25、0.5、1.5、2.5、3.5mL于5mL容量瓶中，以氯仿-甲醇(6∶4)溶液稀释至刻度，摇匀即得.分别吸取该对照品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定.经计算得色谱峰面积(A)与进样量(C)之间的回归方程为：A=504924C+31528.8，r=0.9991.见图2.线性回归曲线说明：在0.2～4.0μg范围内连翘苷的量与色谱峰面积呈良好的线性关系，且由于其不过原点，因此，采用外标两点法测定样品中连翘苷的含量。

　　1.3.2 供试品溶液的制备

　　精密称取过60目筛的本品粉末0.2g，置于索氏提取器中，加氯仿-甲醇(体积比6∶4)溶液50mL，于85℃下回流提取4h，回收溶剂至干，残留物用氯仿-甲醇溶液溶解，转移至5mL容量瓶中，定容，摇匀，作为供试品溶液。

　　1.3.3 回收率实验

　　采用加样回收法.精密称取连翘药粉末0.2g共10份，分为两组，一组按“含量测定”项下方法测定其中连翘苷的含量，另一组加入一定量的连翘苷对照品，再同法操作，计算回收率。

　　1.3.4 精密度实验

　　吸取对照品溶液(0.2006mg/mL)，连续进样5次，每次20μL，测定峰面积分别为1980872、2053814、2051943、2028728、2129780，RSD为2.63%，表明仪器具有良好的精密度。

　　1.3.5 重现性实验

　　精密称取03号样品0.2g5份，按“含量测定”项下方法测定其中连翘苷的峰面积，结果分别为188647、188997、191284、190345、182457，RSD为2.36%。

　　1.3.6 标准品纯度检测

　　吸取连翘苷溶液(浓度为2.356mg/mL的甲醇溶液)15μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，得连翘苷对照品纯度为100%。

　　1.3.7 样品测定

　　11批连翘药材分别按“含量测定”项下方法，测定其中连翘苷的含量。

　　2、反相高效液相色谱法

　　2.1 仪器与试药

　　乙腈(色谱纯，中国医学科学院天津协和公司)；其它同“1.1”项下。

　　2.2 色谱条件

　　紫外检测波长的选择同“1.2.1”项下.色谱柱：ODS-C18(大连依利特公司，4.6mm×20cm，5μm)；流动相：乙腈-水(体积比25∶75)；流速：0.8mL/min；其它同“1.2.2”项下。

　　2.3 方法与结果

　　2.3.1 工作曲线的考察

　　精密称取连翘苷对照品5.225mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解，定容，摇匀.分别精密吸取该溶液0.5、1.0、2.0、3.0、7.0mL于10mL容量瓶中，以甲醇溶液定容，即得对照品溶液.分别吸取对照品溶液20μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，经计算得色谱峰面积(A)与进样量(C)之间的回归方程：A=688166C+16194.5，r=0.9994.见图4.线性回归曲线说明：在0.2～2.9μg范围连翘苷的量与色谱峰面积呈良好的线性关系，且由于其不过原点，因此，采用外标两点法测定样品中连翘苷的含量。

　　2.3.2 供试品的制备

　　精密称取过60目筛的本品粉末0.4g，置于10mL具塞刻度试管中，精密加入甲醇溶液10mL，冷浸24h，超声30min，离心，吸取上清液，作为供试品溶液。

　　2.3.3 精密度实验

　　吸取对照品溶液，连续进样5次，每次20μL，测定峰面积分别为856590、855094、856922、872430、873284，RSD为1.06%，表明仪器具有良好的精密度。

　　2.3.4 回收率实验

　　采用加样回收法.精密称取连翘药材粉末0.2g，共10份，分为两组，一组按“含量测定”项下方法测定其中连翘苷的含量，另一组加入一定量的连翘苷对照品，再同法操作，并计算回收率，结果见表5.此方法具有较好的回收率。

　　2.3.5 重现性实验

　　精密称取07号样品0.4g5份，按“含量测定”项下方法测定其中连翘苷的含量，结果分别为1006484、986970、992430、951236、987987，RSD为2.07%，此法具有较好的重现性。

　　2.3.6 标准品纯度检测

　　吸取连翘苷溶液(浓度为2.356mg/mL的甲醇溶液)15μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，得连翘苷对照品纯度为99.87%。

　　2.3.7 样品测定

　　10批连翘药材分别按“含量测定”项下方法，测定其中连翘苷的含量。

　　3、讨论

　　a.连翘所含成分比较复杂，药理实验表明，连翘苷具有较强的抑菌、抗病毒活性，为其有效成分之一，且含量较高，化学性质稳定，因此选择其作为指标成分对连翘药材质量进行控制。

　　b.从表3中数据可以看出，每批药材用两种方法测得的结果基本一致，证明了此两种方法的可行性，但又各有利弊。方法1样品处理过程比较复杂，回收率偏低；方法2虽然样品处理比较简单，但对色谱柱的损坏比较大，可根据需要选择使用。