点击显示 收起
【摘要】目的建立五味子水煎物的HPLC指纹图谱。方法应用HPLC法KromasilC１８分析柱，甲醇和水二元梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长254nm。结果运用梯度洗脱能很好的分离五味子水煎物的各类成分，五味子水煎物的指纹图谱相似度均＞0.90，标示18个共有峰。结论所建立的HPLC指纹图谱可用于五味子水煎物的质量控制。
五味子性温，味酸，既能补益心肾，又能宁心安神。适用于阴血亏损，心神不安之心悸、失眠、健忘、多梦等病症。中医临床常用五味子及其复方水煎液进行睡眠障碍的治疗，并取得了较好的疗效。经我研究室药理学实验证明，五味子水煎物能延长戊巴比妥钠所致小鼠及大鼠睡眠的时间，具有显著改善睡眠的作用。为了利于五味子的药效学研究，有效控制其质量，本实验建立了五味子水煎物的指纹图谱，确定其共有峰18个。
1、仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪2695型四元液相色谱泵，2996型二极管阵列检测器，Millennium32色谱工作站；甲醇(色谱醇)，超纯水，其余试剂均为分析纯。
对照品五味子醇甲(批号110857-200304)、五味子甲素(批号0764-200006)、五味子乙素(批号0706-200003)由中国生物制品检定所提供。
药材五味子由黑龙江省神树林场提供，经黑龙江中医药大学药学教研室都晓伟教授鉴定为木兰科植物五味子Schlisandrachinensis(Turcz)Bail的干燥成熟果实。
2、实验方法与结果
2.1色谱分析条件中科院大连物化所KromasilC18色谱柱(4.6mm×20mm，5μm)，流动相：甲醇(A)-水(B)梯度洗脱，0～15min(56%A，44%B)，15～50min(56%～59％A，４４％～４１％B），５０～５６min(59%～６５％Ａ，４１％～３５％Ｂ），５６～６５min(65%～67%A，35%～33%B)，65～100min(67%～８５％Ａ，３３％～１５％B)；柱温30℃，流速1.0ml/min，检测波长254mm。见图1。
2.2供试品的制备五味子水煎物的制备：取五味子原药材30g，粉碎，加适量水浸泡2h，煮沸30min，过滤，将滤渣再加适量水煎煮20min，合并2次滤液，水浴蒸干(70℃)，碾成细粉，重13g。1g干膏粉相当于原药材2.31g。
取0.1g水煎物，用甲醇超声提取2次，每次加甲醇5ml，超声15min，过滤，合并2次滤液，用甲醇定容至10ml。溶液经0.45μm微孔滤膜过滤，进行HPLC分析。
2.3参照物溶液的制备精密称取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品，加甲醇制成每毫升含五味子醇甲0.043mg、五味子甲素0.009mg、五味子乙素0.031mg的对照品溶液。
2.4指纹峰的标定采用相对保留时间标定指纹峰，以五味子醇甲对照品为参照物，把各色谱峰保留时间与同一图谱中五味子醇甲保留时间的比值作为各色谱峰的相对保留时间。
2.5指纹峰的峰面积比值精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件进行测定，以所得的五味子醇甲峰面积作为1，计算各样品图谱中色谱峰的峰面积比值。
2.6方法学考察
2.6.1精密度取同一份五味子药材水煎物供试品，连续进样5次，测定HPLC色谱，测得其各色谱峰相对峰面积的RSD<3%，相对保留时间的RSD<1%(n=5)，表明仪器精密度良好。
2.6.2稳定性取同一份五味子药材水煎物供试品，每6h进样分析，结果各共有峰相对峰面积的RSD<3%，相对保留时间<1%(n=5)，表明样品在24h内稳定。
2.6.3重现性取同一批五味子水煎物，按样品制备方法制备供试品溶液5份，测定HPLC色谱，结果各共有峰相对峰面积的RSD<3%，相对保留时间<1%(n=5)，表明方法重现性良好。
2.6.4色谱柱的选择按拟定的色谱条件，使用中科院大连物化所KromasilC18色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)、中科院大连物化所NucleosilC18(4.6mm×250mm，5μm)及WatersSymmetryShieldRP18色谱柱(3.9mm×150mm，5μm)对同一样品进行分析，结果表明KromasilC18色谱柱分析的色谱图峰形好，出峰数目多，各色谱峰相互之间分离度好。故本实验选用了中科院大连物化所KromasilC18色谱柱，保护柱为大连依利特公司C18保护柱。
2.6.5检测波长的选择在前述色谱条件下进行测定，选择了230nm、240nm、254nm和270nm波长，结果以254nm色谱图峰形好，出峰数目适中，各色谱峰相互之间分离度好，故检测波长定为254nm。
3、五味子水煎物样品的测定及指纹图谱的确立
3.1五味子水煎物HPLC指纹图谱按上述色谱条件测定了10份五味子水煎物(如图2)，根据各样品图谱中色谱峰相对保留时间，标定共有峰(扣除空白影响)，计算峰面积比值，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均在3%以内。
3.2指纹图谱相似度计算采用中药色谱指纹图谱相似度软件2004年A版(国家药典委员会开发)确定共有指纹峰18个，其中包括作为参照物的五味子醇甲峰，以18个共有峰的峰面积的均值作为模板，相似度结果在0.90以上。
4、结果与讨论
(1)本实验建立了五味子水煎物的HPLC指纹图谱，确立了18个共有峰，其中包括参照物五味子醇甲的色谱峰，方法学考察结果表明：该实验方法重现性好，各共有峰相对峰面积的RSD<3%，相对保留时间的RSD<1%；精密度实验中各共有峰面积的RSD<3%，相对保留时间的RSD<1%，样品在24h内稳定性良好。
(2)以五味子醇甲色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%。表明五味子醇甲的18个共有色谱峰在10批样品中稳定，重现性好，说明18个共有峰的存在与否能够客观的反映五味子水煎物的内在质量，可作为五味子水煎物的定性指标。
(3)以18个共有峰峰面积的均值作为模板，利用相关系数法计算指纹图谱的相似度，结果十批样品指纹图谱的相似度均在0.90以上。表明五味子水煎物的制备工艺稳定可控，能够保证所制五味子水煎物的质量，均匀可靠，为五味子水煎物给药后血清中成分分析实验提供合格的药品，通过指纹图谱相似度的计算，也为五味子水煎物的质量控制提供了一个宏观的定量指标。
(4)本研究中五味子水煎物的HPLC指纹图谱与所报道的五味子醇提取物的指纹图谱在峰的数目和相对峰面积上相差较大，水煎物中出现了在醇提物中未见的极性相对较大的2个吸收峰，这一研究结果可用于五味子水煎物与五味子醇提物的鉴别。