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来源：东方医药网
摘要：本文采用超临界CO2流体萃取法从延胡索中萃取延胡索乙素。在预试验的基础上，进行了以延胡索乙素含量为标准的四因素三水平的正交试验，得出最佳试验条件为：粒度：中(24目)；夹带剂乙醇浓度：70％；萃取压力：20MPa；萃取温度：55～50～45℃。同时与传统溶媒水和甲醇提取法进行了比较，结果表明超临界CO2流体萃取法优于传统溶媒提取法。
关键词：超临界CO2流体萃取法延胡索延胡索乙素含量
延胡索RhizomaCorydalis为常用中药，系罂粟科植物延胡索CorydalisyanlhusuoW．T．Wang的块茎。含延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丙素、延胡索丁素、延胡索戊素、延胡索己素、延胡索丑素等20多种生物碱。目前临床上用的延胡索制剂中延胡索的提取方法均为传统的溶媒提取法，费时、费能且不利于有效成份的提出，为此对采用超临界CO2流体萃取法从延胡索中萃取有效成份进行了研究。
1、实验材料与仪器
1．1实验材料：延胡索采自东阳市药材医药有限公司种植基地，并按大(10目)、中(24目)、小(50目)颗粒各加工5kg。延胡索乙素对照品，由中国药品生物制品检定所提供，批号：0726—9906。甲醇：色谱纯；三乙胺、磷酸、乙醇均为分析纯。
1．2实验仪器：HA231—50—2．5型超临界萃取装置，江苏南通华安超临界萃取有限公司；WATERS高效液相色谱仪，AGILENT高效液相色谱仪。
2、胡索乙素含量测定方法的建立
2．1色谱条件：流动相：甲醇-0．1％磷酸(用三乙胺调pH至6．0)(60：40)，色谱柱：DiamonsilT—MCl8(250×4．6mn，5m)，流速：1．0ml／min，波长：280nm，进样量：20l。
2．2线性关系的考察：精密称取五氧化二磷减压干燥过夜的延胡索乙素对照品l0．2mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密吸取上述贮备液0．25、0．5、1、2、3、4ml，分别置l0ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别进样20μl，以峰面积为纵坐标，以对照品的量为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为Y=704．7+80863．6X，r=0．9993。表明延胡索乙素在0．102～1．632μg之间有良好的线性关系。
2．3回收率试验：采用加样回收率测定法，精密称取已知含量的延胡索样品1g，分别精密加入一定量的延胡索乙素对照品，按“样品测定”项下操作；结果(见表1)平均回收率为98．78％，RSD为2．75％(n=6)表1延胡索乙素回收率测定结果
2．4稳定性考察：精密吸取对照品溶液20ml，隔1h进样1次，共进样6次，测得延胡索乙素峰面积，计算RSD为1．05％，表明延胡索乙素在5h内稳定。
2．5精密度试验：取延胡索乙素对照品，用甲醇制成每1ml中含40g的溶液，精密吸取20μl重复进样6次，测峰面积，计算RSD为0．42％。
2．6重复性试验：精密称取样品，按“样品含量测定”项下操作，在相同条件下测定同一批号样品6份，计算含量，其RSD为2．25％。
2．7样品测定供试品溶液制备：精密称取延胡索粉(24目)2g。加入甲醇20．00ml，称定重量，超声处理30min，冷却用甲醇补足重量，用0．45μm微孔滤膜过滤，取滤液在上述色谱条件下进样分析：平行做6份，结果平均每克延胡索药材含延胡索乙素为0．543mg，RSD为2．02％。
3、CO2超临界萃取条件的预试验
对影响萃取的关键因素(CO2的流速、萃取压力、萃取温度和延胡索的粒度)进行了预试验实验结果表明，用夹带剂的萃取率高，25～35之间的萃取压力与萃取率无明显关系，以上实验的萃取出的延胡索乙素均比文献报导低(文献报导浙江产延胡索乙素含量为0．6mg／g左右)，说明实验条件需进一步优化。为此，我们以95％乙醇和无水乙醇为夹带剂，在萃取压力下对萃取效率的影响进行了试验。CO2的流速在30～35kg／h之间对萃取率影响不明显，夹带剂用无水乙醇不如乙醇，以上实验萃取出的延胡索乙素均比上述文献报道低。说明实验条件仍需进一步优化。我们进一步对CO2超临界萃取与水煎煮和醇提取的效率进行试验。实验结果表明，60％乙醇提取比水煎煮效果好，且上述二次CO萃取效果均不如60％乙醇提取与水煎煮。说明萃取条件未选好，药粉量与夹带剂用量的比例可能对萃取率有关，需再做预试验。最后，我们对CO2超临界萃取延胡索乙素的条件进行了再优选。
4、CO2超临界萃取的最佳条件试验
4．1药粉用溶剂浸泡再进行CO2萃取的试验对CO2萃取率偏低进行了分析，并同水煎煮和醇提取二种方法进行比较分析，认为偏低的主要原因，可能是在萃取过程中细胞壁渗透不完全所致。为此采用把夹带剂直接加入药粉中，浸泡一段时间后再进行萃取试验。本次预试验选定四个参数：乙醇浓度、浸泡时间、萃取压力和萃取时间。(1)CO2的流速：30kg／h，萃取压力：25MPa、分离釜I压力：8MPa、分离釜Ⅱ压力：6MPa，萃取温度：55℃、分离釜I温度：50℃、分离釜Ⅱ温度：45℃，延胡索的粒度24目，萃取容器50L，延胡索药粉的用量165g，60％乙醇200ml浸泡18h，萃取时间1h放出萃取液后，再继续萃取0．5h。(2)95％乙醇200ml浸泡18h，萃取压力20MPa，其余同(1)。(3)95％乙醇200ml浸泡18h，萃取压力25MPa，其余同(1)。(4)95％乙醇200ml浸泡24h，萃取压力20MPa，其余同(1)实验结果表明，以每克延胡索药粉含延胡索乙素毫克数表示：
前1h：(1)0．667(2)0．250(3)0．195
(4)0．326；后0．5h：(1)0．012(2)0．005(3)
0．003(4)0．006。
其中实验(1)的萃取率基本达到了文献报导值，说明夹带剂先浸泡后再萃取效果好，其它三个实验结果均较低，可能与乙醇的浓度有关。实验结果表明萃取率与乙醇浓度关系较大，而与浸泡时间关系不大；实验结果同时表明后半小时萃取率与前1h萃取率相比，从成本与效益考虑几乎可以不计，故萃取时间选定1h。
4．2正交试验：上述预试验结果表明用夹带剂的表萃取率高；25～35MPa之间的萃取压力与萃取率无关；CO2的流速在30～35kg／h之间与萃取率无关；药粉量与夹带剂用量的比例可能对萃取率有关；夹带剂先浸泡后再萃取效果好；萃取率与乙醇浓度关系较大，而与浸泡时间关系不大。故选定四因素三水平的正交试验：萃取温度(55～40℃)、粒度(大、中、小)、夹带剂乙醇的浓度(50％、60％、70％)和萃取压力(20MPa、25MPa、30MPa)。其它实验条件CO，的流速：30kg／h，萃取溶器50L，延胡索药粉65克用夹带剂(乙醇)100ml浸泡24h，萃取时间1h。
5、讨论
5．1在建立延胡索含量测定方法时考虑到延胡索乙素为叔胺类生物碱，难溶于水而溶于有机溶剂，根据其性质分别考察了甲醇、乙醇、氯仿，结果以甲醇为溶剂提取效率明显较其它溶剂高。
5．2从正交试验中结果可以得出最佳试验条件为A1B2C3D1；因素的主次顺序：B—C—D—A。B2C3D1A1为CO2超临界萃取的最佳试验条件：粒度：中(24目)；乙醇浓度：70％；压力：20MPa；温度：55～50～45℃。
5．3采用超临界CO2流体萃取，每克延胡索药粉含量延胡索乙素毫克数可达136．56，比文献报道要高出一倍多，且明显优于传统的溶媒提取法，该方法可能是中药材某些有效成分提取的一种高效的方法。