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【摘要】 目的 建立三黄膏的质量控制方法,以提高其质量标准。方法 采用薄层色谱法对方中主要药味黄柏、黄连、冰片进行定性鉴别研究,采用高效液相色谱法测定三黄膏中主要有效成分黄芩苷的含量。结果 薄层色谱定性鉴别的特征斑点清晰,专属性强,Rf值适中,阴性对照无干扰；黄芩苷含量在7.600～53.200 ?g范围内线性关系良好(r＝0.999 5,n＝5),平均回收率为98.20%(RSD＝0.86%,n＝6)。结论 该方法简便可靠,专属性强,重复性好,能较全面反映该制剂内在质量,可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 三黄膏；黄芩苷；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法
Study on the Quality Standard of Sanhuanggao
JIAO Zheng-hua, ZHANG Xiao-hua, LI Xiu-juan
(Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, China)
Abstract：Objective To establish the method to control the quality of Sanhuanggao. Method Cortex phellodendri, coptis chinensis and borneo camphor in the description were identified by TLC. The content of baicalin which is the effective substance in the preparation was determined by HPLC. Results Medicines above mentioned could be detected by TLC. The linear correlation of the baicalin was good in the range of 7.600～53.200 ?g and the recovery is 98.22% (r＝0.9995, n＝6). Conclusion The method is convenient, accurate, and can be used to control the quality of the preparation.
Key words：Sanhuanggao；baicalin；quality standard；TLC；HPLC
三黄膏由黄连、黄柏、黄芩、冰片等中药组成,具有清热解毒、祛腐止痛的功效,临床用于痈疽疮疡及痔疮肌肉腐烂等。该制剂在本院应用20多年,安全、有效、无毒副作用,但其质量控制标准只有性状、显微鉴别及微生物限度检查。为了加强该品种的质量控制,提高其内在质量,我们在原三黄膏质量标准的基础上增加了黄连、黄柏、冰片的鉴别,采用高效液相色谱(HPLC)法测定黄芩中黄芩苷含量,制定了相应的含量测定限度,使其质量标准可控性更强。
1 仪器与试药
试验仪器美国Waters 1525二元泵,Waters 2487紫外检测器,Bree色谱工作站,HS6150型超声波清洗器,METTLER AE240电子分析天平。黄芩苷对照品购于中国药品生物制品检定所(批号110715-200514),三黄膏(甘肃省中医院提供,批号070402、070110、090421)。甲醇(色谱纯),水为纯净水,硅胶G(青岛海洋化工厂),其余试剂均为分析纯。
2 薄层色谱鉴别
2.1 黄连、黄柏
取本品10 g,加氯仿30 mL,水浴加热搅拌,滤过,残渣以少量氯仿分2次洗涤(10、10 mL),挥干氯仿液,残渣连同滤纸置锥形瓶中,加甲醇30 mL,超声处理20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 mL,作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品,加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。取无黄连、黄柏的模拟配方,照供试品溶液的制备方法制得空白对照液[1-2]。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述3种溶液各5 ?L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯下(365 nm)检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
2.2 冰片
取本品10 g置烧瓶中,加入适量乙醇,置水浴上回流1 h,滤过,滤液作为供试品溶液。另取冰片对照品适量,加醋酸乙酯制成每毫升含1 mg的溶液,作为对照品溶液。取无冰片的模拟配方,照供试品溶液的制备方法制得空白对照液[1-2]。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述3种溶液各10 ?L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-醋酸乙酯(19∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以1%香草醛-浓硫酸溶液,于110 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,空白对照则无相应的斑点。
3 含量测定
3.1 系统适用性试验
色谱柱：Symmetry C18(5 ?m,4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：280 nm。
3.2 对照品溶液的制备
取黄芩苷对照品3.80 mg,加甲醇制成每毫升含76.00 ?g的溶液,作为对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
精密称取本品5.0 g,加80%乙醇40 mL,加热回流3 h,放冷,滤过,滤液置100 mL量瓶中,用少量80%乙醇分次洗涤容器和残渣,洗液滤入同一量瓶中,加80%乙醇至刻度,摇匀。精密量取1 mL置10 mL量瓶中,加甲醇置刻度,摇匀,作为供试品溶液[3-4]。
3.4 阴性对照试验
按处方比例制备不含黄芩药材的样品,依照样品含量测定项下方法制成阴性对照溶液。吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 ?L,按上述色谱条件进行测定,结果阴性样品无干扰。见图1。
3.5 线性关系的考察
精密吸取对照品溶液2、3、4、5、6 mL分别置10 mL量瓶中,摇匀。按上述色谱条件测定,记录色谱图,测定峰面积。以峰面积对进样浓度进行线性回归,得到黄芩苷的回归方程：Y＝120 722.9＋158 360 592X,r＝0.999 5。结果表明,黄芩苷在7.600～53.200 ?g范围内峰面积与进样浓度有良好的线性关系。
3.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 ?L,重复进样5次,计算黄芩苷峰面积的RSD＝0.52%。
3.7 稳定性试验
精密吸取新鲜配制的供试品溶液,每隔2 h测定1次,连续测定6次,计算黄芩苷峰面积的RSD＝2.65%。表明供试品在12 h内稳定性较好。
3.8 加样回收率试验
精密称取已知含量(批号090402)的本品5 g,平行称取6份,分别加入黄芩苷对照品适量,按“3.3”项下方法制备供试品溶液并测定含量,计算回收率。结果见表1。 表1 加样回收率试验结果（略）
3.9 样品测定(见表2)表2 样品含量测定结果(略)
4 讨论
黄连、黄柏为该制剂的君药,主要成分为盐酸小檗碱。本试验以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂,展开后,斑点清晰,阴性对照无干扰。点样量以5 ?L为适宜。冰片为该制剂的辅药,采用以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(85∶15)为展开剂,以5%香草醛-浓硫酸溶液为显色剂,斑点呈念珠状。然后以苯-醋酸乙酯(19∶1)为展开剂,以1%香草醛-浓硫酸液为显色剂,斑点清晰,阴性无干扰。故冰片的鉴别采用后者。点样量以10 ?L为宜。
采用不同浓度的甲醇和乙醇作为提取黄芩苷的溶剂,结果以80%的乙醇溶液提取效率较高,干扰成分少。分别采用加热回流提取和超声提取,考察其提取效率,结果表明,回流提取虽然费时,但提取效率较高,重复性好。
试验结果表明,本法操作简便,定性鉴别方法分离度好、专属性强、重复性良好,含量测定方法快速、准确。用此方法控制三黄膏的质量具有实际应用意义。
【参考文献】
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