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【摘要】 目的 建立清燥润肺合剂的质量标准。方法 采用薄层色谱法对制剂中桑叶、甘草、北沙参、麦冬、枇杷叶进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对制剂中甘草酸含量进行测定。结果 薄层色谱中阴性无干扰,专属性强；甘草酸在0.203 1～1.692 1 μg范围内线性关系良好,r＝0.999 8,平均回收率为98.24%,RSD＝2.62%。结论 本试验建立的方法简便、快捷,重复性好,可用于清燥润肺合剂的质量控制。
【关键词】 清燥润肺合剂；质量标准；甘草酸；高效液相色谱法；薄层色谱法
Study on the Quality Standard for Qingzao Runfei Mixture ZHOU Juan-juan, PAN Jin-huo, LU Huan, et al Nanjing University of TCM, Nanjing 210046, China Abstract：Objective To establish quality control method for Qingzao Runfei Mixture. Methods Mulberry Leaves, Glycyrrhiza, Radix Glehniae, Ophiopogon Japonicus and Loquat Leaves were identified by TLC. Glycyrrhizic Acid was determinated by HPLC. Results The negative sample of TLC had no interference. The specifity was good. Glycyrrhizic acid showed a good linear relationship in the range of 0.203 1～1.692 1 μg, r＝0.999 8. The average recovery was 98.24%, and RSD was 2.3%. Conclusion The established methods are simple, quick and with good reproducibility. This study provides methods for the quality control of Qingzao Runfei Mixture.
Key words：Qingzao Runfei Mixture；quality standard；glycyrrhizic acid；HPLC；TLC
清燥润肺合剂由桑叶、石膏、甘草、黑芝麻、北沙参、麦冬、枇杷叶等9味药材组成。具有清燥润肺之效,用于燥气伤肺、干咳无痰、气逆而喘、咽干鼻燥、心烦口渴等病症。笔者根据处方组成药物的理化性质[1]及反复试验,对桑叶、甘草、北沙参、麦冬、枇杷叶进行了鉴别,同时,采用高效液相色谱法测定了制剂中甘草酸的含量,建立了可靠、稳定、简单的质量控制方法。
1 仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪,Agilent1100紫外检测器,HP Chemstations工作站。清燥润肺合剂10批样品由扬州市三药制药有限公司生产并提供(批号为061101、061102、061103、061104、061105、061106、061107、061126、061128、061130)；甘草药材购自扬州市药材公司(由扬州市三药制药有限公司提供,批号为060912、060920、060928),经南京中医药大学王春根教授鉴定为豆科植物甘草的干燥根及根茎；甘草酸铵对照品购自中国药品生物制品检定所(批号110731- 200511)。硅胶G由青岛海洋化工厂生产；所有试剂由上海久亿化学试剂有限公司生产,均为分析纯或色谱纯。
2 定性鉴别
2.1 桑叶
取桑叶对照药材2 g,加石油醚(60～90 ℃)20 mL,超声处理20 min,弃去石油醚液,药渣挥干,加无水乙醇30 mL,超声处理20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30 mL使溶解,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为对照药材溶液。取本品20 mL,蒸干,残渣加80%乙醇50 mL,超声处理20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30 mL使溶解,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。取除桑叶以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品20 mL,用与供试品溶液制备相同的方法制得阴性对照液。
吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)的上层溶液为展开剂,置于展开剂预饱和20 min的展开缸内,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱对应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,而阴性对照液无此斑点。
2.2 甘草[2]
取甘草对照药材1 g,加乙醚30 mL,超声处理20 min,滤过,药渣挥干,加甲醇30 mL,超声处理20 min,滤过,滤液挥干,残渣加水30 mL使溶解,滤过,用水饱和的正丁醇萃取2次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗涤2次,每次20 mL,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为对照药材溶液。取本品10 mL,加乙醚30 mL,超声处理20 min,静置分层,置分液漏斗中,分出水层,用水饱和的正丁醇提取2次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗涤2次,每次20 mL,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。取除甘草以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品10 mL,按供试品溶液制备方法制得阴性对照液。
吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照液无干扰。
2.3 北沙参
取北沙参对照药材5 g,加乙醚30 mL,加热回流1 h,滤过,滤液挥干,残渣加乙醇1 mL使溶解,作为对照药材溶液。取本品10 mL,蒸干,残渣加乙醇20 mL使溶解,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。取除北沙参以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品10 mL,按供试品溶液制备方法制得阴性对照液。
吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置氨缸内熏40 min,紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱对应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,阴性对照液无干扰。
2.4 麦冬
取麦冬对照药材2 g,加水20 mL,加盐酸2 mL,煮沸2 min,放冷,滤过,滤液用三氯甲烷10 mL萃取,取三氯甲烷液,蒸干,残渣加三氯甲烷0.5 mL溶解,作为对照药材溶液。取本品10 mL,加盐酸1 mL,煮沸2 min,放冷,滤过,滤液用三氯甲烷10 mL萃取1次,取三氯甲烷液,蒸干,残渣加三氯甲烷0.5 mL使溶解,作为供试品溶液。取除麦冬以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品10 mL,按供试品溶液制备方法制得阴性对照液。
吸取上述溶液各约5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇(20∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照液无干扰。
2.5 枇杷叶
取枇杷叶对照药材5 g, 加水200 mL煎煮2 h,滤过,滤液用5%的氢氧化钠溶液调pH值至10,用乙酸乙酯40 mL萃取,浓缩,残渣加1 mL甲醇溶解,作为对照药材溶液。取本品10 mL,加水20 mL稀释,摇匀,滤过,用5%的氢氧化钠溶液调pH值至10,用乙酸乙酯40 mL萃取,浓缩,残渣加1 mL甲醇溶解,作为供试品溶液[3]。取除枇杷叶以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品10 mL,按供试品溶液制备方法制得阴性对照液。
吸取上述溶液各约10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(8∶4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照液无干扰。
3 含量测定
3.1 色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸(63∶36.6∶0.4)为流动相；检测波长为250 nm；柱温30 ℃。理论塔板数按甘草酸峰计算应不低于3 000。
3.2 对照品溶液的制备
精密称取甘草酸铵对照品,加甲醇制成0.207 3 mg/mL的溶液。精密量取5 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得0.103 65 mg/mL的对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
取10个批号的样品,每批取2份,分别精密量取20 mL,加水饱和的正丁醇20 mL,超声30 min,置分液漏斗中取正丁醇液。下层加水饱和的正丁醇20 mL萃取,合并正丁醇液,蒸干,残渣用甲醇定量转移至10 mL量瓶中,定容,摇匀,即得。
3.4 空白试验
取除甘草以外的其它8味药材,按处方比例制得阴性样品,按供试品溶液的制备方法制得阴性对照液。精密吸取10 μL,连续进样3次。结果表明,空白对照液未检出与甘草酸铵对照液对应的色谱峰,视为空白无干扰。色谱图见图1。
3.5 线性关系考察
分别吸取浓度为0.103 65 mg/mL的甘草酸铵对照品溶液(折合甘草酸为0.101 53 mg/mL)2、4、6、8、10 mL,用甲醇定容至10 mL,各进样10 μL。以甘草酸铵平均峰面积为纵坐标,进样量(μg)为横坐标进行线性回归,得回归方程：Y＝721.62X－16, r＝0.999 8,指标成分甘草酸的线性范围为0.203 1～1.692 1 μg。
3.6 精密度试验
精密吸取同一对照品溶液10 μL,连续进样5次,结果测得甘草酸铵峰面积值的RSD＝0.71%。
3.7 稳定性试验
精密吸取批号为061105的样品溶液10 μL,每间隔2 h进样1次,连续考察10 h,峰面积的RSD＝0.74%,表明指标成分在10 h内比较稳定。
3.8 重复性试验
取同一批号(061105)的样品5份,按“样品测定”项下方法测得样品中甘草酸铵的含量,RSD＝2.11%,表明重复性良好。
3.9 加样回收率试验
取已知含量同一批号(061105)的样品6份,精密量取10 mL,分别精密加入浓度为0.103 65 mg/mL的甘草酸铵对照液4 mL,按供试品溶液的制备方法制得供试液。照“样品测定”项下方法测定,计算样品中甘草酸铵含量及加样回收率,结果见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
3.10 样品测定
取10个批号的样品适量,按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液。按上述色谱条件,分别进样10 μL,各进2针,用标准曲线法计算含量。10个批号样品甘草酸含量测定结果依次为0.031 8、0.038 3、0.039 3、0.037 1、0.038 9、0.038 6、0.038 5、0.038 9、0.039 1、0.039 1 mg/mL。
4 讨论
在定性鉴别的选取上,因为苦杏仁中的主要成分是苦杏仁苷,且其他成分的含量很少,而枇杷叶中也同样含有苦杏仁苷,故未对苦杏仁进行试验；而阿胶、黑芝麻的鉴别,经过试验,阴性均有干扰；故暂未建立此3味药的鉴别方法。试验表明,上述桑叶、甘草、北沙参、麦冬、枇杷叶的鉴别专属性强,重复性好,操作简便。
本试验曾以甲醇为流动相A,水相为流动相B,其中水相由水-冰醋酸(100∶1)组成,A∶B＝66∶34,试验结果显示,甘草酸铵峰与其他组分峰分离效果不理想。经过试验,采取以甲醇为流动相A,水相为流动相B,其中水相由水-冰醋酸(100∶1)组成,A∶B＝63∶37,试验结果显示,甘草酸铵峰与其他组分峰分离效果理想,出峰时间合适。
【参考文献】
1] 肖崇厚,杨松松,洪筱坤.中药化学[M].上海：上海科学技术出版社, 1997.168－170.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.59－60.