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【摘要】 目的 建立安神健脑液的质量标准。方法 采用薄层色谱法鉴别麦冬、丹参、枸杞子和人参;采用高效液相色谱法测定五味子中五味子醇甲的含量,C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,流动相为甲醇-水(55∶45),流速1.0 mL/min,检测波长250 nm。结果 在薄层色谱中可检出丹参、枸杞子和人参的特征斑点;五味子醇甲在0.121 8～1.218 μg范围内线性关系良好,r=0.999 9,精密度RSD=0.22%(n=6),重复性试验RSD=1.1%(n=6),平均加样回收率为97.34%(RSD=1.7%,n=6)。结论 本方法简便、灵敏、专属性强、重复性好,可作为安神健脑液的质量控制方法。
【关键词】 安神健脑液;五味子醇甲;高效液相色谱法;薄层色谱法;质量标准
Study on the Quality Standard of Anshen Jiannao Mixture GU Hai-feng1, LIU Ran2, ZHANG Xiao-qian1, et al (1.Beijing Institute for Drug Control, Beijing 100035, China;2.Beijing Dongcheng District Institute for Drug Control, Beijing 100028, China)
Abstract：Objective To study the quality standard of Anshen Jiannao Mixture. Methods Radix ophiopgonis, Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae, Fructus Lycii and Radix et Rhizoma Ginseng were identified by TLC. HPLC was used to determine the content of Schizandrol A on C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) ODS column. The mobile phase was consisted of methanol-water (55∶45). The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was at 250 nm. Results The characteristic spot of Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae, Fructus Lycii and Radix et Rhizoma Ginseng could be easily examined by TLC. The calibration curve of Schizandrol A was linear in the range of 0.121 8～1.218 μg, r=0.999 9. The precision RSD was 0.22% (n=6). The reproducibility RSD was 1.1% (n=6). The average recovery rate of Schizandrol A was 97.34% (RSD=1.7%, n=6). Conclusions The method is easy, sensitive and specific with good reproducibility. It can be used to control the quality of Anshen Jiannao Mixture.
Key words：Anshen Jiannao Mixture;Schizandrol A;HPLC;TLC;quality standard
安神健脑液收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第十八册,由人参、五味子(醋炙)、麦冬、枸杞子和丹参5味药组成,具有益气养血、滋阴生津、养心安神功效。用于气血两亏、阴津不足所致的失眠多梦、神疲健忘、头晕头痛、心悸乏力、口干津少等症。原质量标准只收载了麦冬和五味子两味药的薄层色谱鉴别。为全面控制安神健脑液的质量,本试验对麦冬、丹参、枸杞子和人参4味药材进行了薄层色谱鉴别,并采用高效液相色谱法(HPLC)对方中君药五味子中的活性成分五味子醇甲进行了含量测定,为该制剂建立完善的质量标准提供了依据。现总结如下。
1 仪器与试药
日本岛津LC-20A高效液相色谱仪(SPD-M20A紫外-可见光检测器,SIL-20AC自动进样器,CTO-20AC柱温箱);电子天平(CP225D,十万分之一)。
五味子醇甲对照品(供含量测定用,批号110857-200405)、麦冬对照药材(供薄层色谱对照用,批号121013-200607)、枸杞子对照药材(供薄层色谱对照用,批号121072-200505)、原儿茶醛对照品(供含量测定用,批号110810-200506)、人参皂苷Rb1对照品(供含量测定用,批号110704-200318)、人参皂苷Re对照品(供含量测定用,批号110754-200320)、人参皂苷Rf对照品(供含量测定用,批号111719-200501)、人参皂苷Rg1对照品(供含量测定用,批号110703-200322)和人参对照药材(供薄层色谱对照用,批号120917-200507)均由中国药品生物制品检定所提供。安神健脑液(批号为5151504、5151497、6150686)由同仁堂科技有限公司提供。硅胶H薄层板、硅胶G薄层板均由青岛海洋化工厂分厂提供。甲醇为色谱纯,LANSCAN LTD.出品。水为纯水机净化水(纯水机型号Millipore Milli-Q biocel型纯水器)。其余试剂均为分析纯。
2 薄层色谱鉴别
2.1 麦冬
取本品和阴性样品各10 mL,加盐酸1 mL,三氯甲烷10 mL,置水浴上加热回流30 min,分取三氯甲烷层,用水20 mL洗涤1次,弃去水液,三氯甲烷液浓缩至约1 mL,分别作为供试品溶液和阴性溶液。另取麦冬对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶H薄层板上,以三氯甲烷-丙酮(4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃烘约3 min检视。可见供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点,而阴性样品无对照药材斑点。
2.2 丹参
取本品和阴性样品各10 mL,分别置分液漏斗中,加盐酸调节pH值至1,加入乙酸乙酯振摇提取3次,每次20 mL,取乙酸乙酯液蒸干,加甲醇1 mL使溶解,分别作为供试品溶液和阴性溶液。另取原儿茶醛对照品,加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作为对照品溶液。分别吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶5∶0.8)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2%三氯化铁-1%铁氰化钾溶液(1∶1)检视。可见供试品溶液色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,而阴性样品无对照品斑点。
2.3 枸杞子
取本品和阴性样品各10 mL,分别置分液漏斗中,用乙酸乙酯20 mL振摇提取,提取液浓缩至约1 mL,分别作为供试品溶液和阴性溶液。另取枸杞子对照药材0.5 g,同法制成对照药材溶液。分别吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(3∶2∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。可见供试品溶液色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,而阴性样品无对照药材荧光斑点[1]。
2.4 人参
取本品和阴性样品各25 mL,分别用水饱和正丁醇振摇提取4次,每次20 mL,合并正丁醇液,用氨试液洗涤3次,每次20 mL,弃去碱液,取正丁醇液蒸干,残渣加20%乙醇溶液5 mL使溶解,照柱色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥC]试验,通过已处理好的大孔树脂柱(内径1 cm,高20 cm),先用水100 mL洗脱,弃去水溶液,再用70%乙醇100 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,分别作为供试品溶液和阴性溶液。另取人参对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf及人参皂苷Rg1对照品,加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液,作为对照品溶液。分别吸取上述7种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶H薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10) 10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰,分别置日光下检视。供试品色谱中,在与对照药材和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的斑点,而阴性样品无对照品斑点。
3 五味子醇甲的测定
3.1 对照品溶液的制备
精密称取五味子醇甲对照品15 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇适量使溶解,并稀释至刻度,摇匀;精密量取2.0 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得(每1 mL中含五味子醇甲60 μg)。
3.2 供试品溶液的制备
精密量取本品10 mL,置分液漏斗中,用乙醚提取4次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
3.3 阴性对照溶液的制备
按照本品的处方、制法制备缺少五味子的模拟样品,精密量取10 mL,按“3.2”项下方法制备阴性对照溶液。将对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液分别注入高效液相色谱仪中进行测定,得到色谱扫描图,见图1。可见供试品与对照品溶液在相应的位置上有相似的峰,而阴性对照则无明显其他峰出现。
3.4 色谱条件
色谱柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相：甲醇-水(55∶45);流速：1.0 mL/min;检测波长：250 nm;柱温：40.0 ℃。分离度(R)大于1.5,色谱柱的理论塔板数按五味子醇甲峰计算应不低于3 000。
3.5 检测波长的选择
取五味子醇甲对照品溶液10 μL,注入液相色谱仪,用二极管阵列检测器在180～400 nm波长范围检测,结果在250 nm波长处有最大吸收,因此选择250 nm作为测定的吸收波长。
3.6 标准曲线的制备
精密称取五味子醇甲对照品15.23 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取2.0 mL置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得60.92 μg/mL五味子醇甲对照品溶液。分别吸收2、4、6?、10?、20 ?μL,注入高效液相色谱仪,记录峰面积,以五味子醇甲对照品进样量为横坐标,峰面积值为纵坐标,绘制标准曲线,其回归方程为：Y=1.997×106X+6.790×103,r=0.999 9,结果表明,五味子醇甲对照品在0.121 8～1.218 μg范围内线性关系良好。
3.7 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液(批号5151504),进样10 μL,重复进样6次,求得RSD=0.22%。
3.8 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液(批号为5151504)10 μL,分别于配制后0、1、4、8、15、24 h依法测定,结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定,RSD=0.76%。
3.9 重复性试验
取同一供试品溶液(批号为5151504)6份,精密量取10 mL,分别制备供试品溶液,进行测定,计算,得五味子醇甲的平均含量为0.060 mg/mL,RSD=1.1%。
3.10 加样回收率试验
精密量取已知含量的同一批号样品(批号为5151504,含量为0.060 89 mg/mL)5 mL,精密加入水5 mL,混匀,再精密加入五味子醇甲对照(0.268 0 mg/mL)的乙醚溶液20 mL,振摇提取,分取乙醚层,水层溶液继续用乙醚振摇提取3次,每次20 mL,合并4次乙醚提取液,蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。进样测定,计算,得平均回收率为97.34%,RSD=1.7%。见表1。表1 加样回收率试验结果
3.11 样品测定
取3批样品,制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,采用外标法计算五味子醇甲的质量分数,结果见表2。表2 样品测定结果
4 讨论
按本品处方比例及制备工艺分别制备不含麦冬、丹参、枸杞子和人参的缺味样品并制成阴性对照溶液,将它们分别与相应的供试品同板进行薄层色谱试验。结果表明,各阴性对照均无相应斑点,该4味药的鉴别方法具有专属性。
根据文献,流动相曾采用甲醇-水(50∶50[2]、60∶40[3])、乙腈-0.1%磷酸(42∶58)[4]、甲醇-乙腈-水(15∶15∶10)[5-6]、乙腈-水(45∶55)[7],试验结果表明,采用甲醇-水(55∶45)作为流动相不仅可使杂质峰有效的分离,且保留时间较为适宜。
选取乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、水饱和的正丁醇作为溶剂,分别振摇提取4次,每次20 mL,合并提取液,蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。测定同批样品(5151504)中五味子醇甲的含量,结果表明,采用乙醚为溶剂,提取较完全;采用乙酸乙酯为溶剂时色谱图中干扰成分较多;采用三氯甲烷为溶剂时易产生乳化现象,不易去除;采用水饱和的正丁醇为溶剂时色谱图中背景干扰过大。以乙醚为溶剂,分别振摇提取2、3、4、5、6次,每次20 mL,测定同批样品(5151504)。结果表明,采用乙醚振摇提取4次为宜,提取较完全。
取另外两种不同品牌色谱柱,按“3.2”项下方法制备供试品溶液,分别依法分离测定,结果均能获得满意的分离效果。色谱柱型号分别为Alltech Apollo C18(5 μm,4.6 mm×150 mm)、Kromasil KR100-5 C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)。
本方法操作简便、准确、重复性好,可作为安神健脑液的质量控制方法。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.174.
[2] 李 英,陈 忠.HPLC测定安神补心丸中五味子醇甲和丹参酮Ⅱ的含量[J].中成药,2004,26(7)：538-540.
[3] 李 希,谢守德,曹定知,等.HPLC测定止喘胶囊中五味子醇甲的含量[J].中国中药杂志,2006,31(15)：1292-1293.
[4] 虞和永,吴美珍.HPLC测定回力神颗粒中五味子醇甲的含量[J].中国中药杂志,2005,30(12)：942-943.
[5] 吴晓凤,陈 虹,赵志茹.HPLC法测定生脉饮中五味子醇甲的含量[J].中国中药杂志,2003,28(1)：39-40.
[6] 陈 虹,胡孝国,张 磊.HPLC法测定复方益肝灵片中五味子醇甲的含量[J].武警医学,2003,14(12)：737-738.
[7] 康四和,邓海英.HPLC法测定益气养血补酒中五味子醇甲的含量[J].中国药师,2003,6(6)：351-352.