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【摘要】 目的 建立复方苦豆子胶囊的质量标准。方法 采用薄层色谱法分别对复方中山楂、决明子、苦豆子进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对主药决明子中的大黄酚进行含量测定。结果 薄层色谱中,供试品溶液在与对照药材或对照品相应位置上出现相同颜色的斑点,阴性无干扰；高效液相色谱中,大黄酚在0.028 4～0.908 8 μg范围内呈良好的线性关系,r＝0.999 7(n＝6),平均加样回收率为99.97%。结论 本试验采用的薄层色谱鉴别方法专属性强,高效液相色谱法精密度高、重复性好,可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 复方苦豆子胶囊；薄层色谱法；大黄酚；高效液相色谱法；质量标准
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2010)04-0045-03
Study on Quality Standard for Complex Prescription Kudouzi Capsule GAO Hui-jing, CHEN Hong (Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources, Ministry of Education, School of Pharmacy, Shihezi University, Shihezi 832002, China)
Abstract：Objective To establish the quality standard for Complex Prescription Kudouzi Capsules. Methods TLC was employed to identify Crataegus pinnatifida Bge.、Cassia obtusifolia L. and sophora alopecuroides L..The content of chrysophanol in Cassia obtusifolia L. was determined by HPLC. Results Spots obtained from the test solutions had the same color in reference solution and medical material in the same location, and the blank solution had no interference. The linear range of chrysophanol was 0.028 4～0.908 8 μg, r＝0.999 7 (n＝6), and the average recovery was 99.97%. Conclusion The characteristic of identification by TLC was highly specific, HPLC is accurate and reproducible, and they can be used effectively for the quality control of Complex Prescription Kudouzi Capsules.
Key words：Complex Prescription Kudouzi Capsules；TLC；chrysophanol；HPLC；quality standard
复方苦豆子胶囊是在多年使用的临床验方基础上,经过对各味中药进行粉碎、提取、纯化、干燥等工艺研制而成。本品由山楂、决明子、苦豆子等多味中药材组成,具有清热解毒、消食除胀、活血化瘀、健脾益气等功效,临床已证实,其具有良好的调血脂、降血压、抗动脉粥样硬化及抗氧化等作用[1-2]。本研究采用薄层色谱(TLC)法对复方中山楂、决明子、苦豆子进行定性鉴别,采用高效液相色谱(HPLC)法对主药决明子中的大黄酚进行含量测定,为更好地控制该产品质量提供依据。
1 仪器与试药
岛津LC-10AD系列高效液相色谱仪；Thermo Hypersil- Gold色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；SPD-6AV紫外检测器；KQ-300DE型数控超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)；HM-202型电子分析天平；UV21型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂生产)；101232S电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂生产)。
苦参碱对照品、金丝桃苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号111521-200303),大黄酚对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号110796-200716)。复方苦豆子胶囊由本实验自制,药材均购于新疆药材公司,依照2005年版《中华人民共和国药典》(一部)进行鉴定,符合要求。薄层层析用硅胶G、硅胶GF254(青岛海洋化工厂生产),聚酰胺薄膜(台州四青生化材料厂)。甲醇为色谱纯；水为双蒸水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 薄层鉴别
2.1.1 山楂3 参照2005版《中华人民共和国药典》(一部)中山楂的鉴别方法。称取本品内容物3.0 g,研细,置50 mL磨口锥形瓶中,加入50%乙醇50 mL,加热回流1.5 h,放冷,滤过,滤液蒸至无醇味,加水10 mL,用石油醚(30～60 ℃)洗涤2次,每次20 mL,弃去石油醚层,水层加乙酸乙酯振摇萃取2次,每次20 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加无水乙醇2 mL溶解,作为供试品溶液。将复方苦豆子胶囊方中去掉山楂,同法制备和处理作为阴性对照液。另取金丝桃苷对照品,加无水乙醇制成0.1 mg/mL的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,分别吸取上述3种溶液各4～10 μL,点于同一聚酰胺薄膜上,以正丁醇-醋酸-水(3∶1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%的三氯化铝溶液,热风吹干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱图中,在与对照品色谱相应位置上,显相同的荧光斑点,阴性对照品中无此斑点。
2.1.2 决明子4 取本品内容物3.0 g,研碎,置50 mL磨口锥形瓶中,加10%硫酸20 mL,加氯仿20 mL,水浴回流1.0 h,放冷,将回流液移入分液漏斗中,分取氯仿层溶液,将氯仿液水浴浓缩至1 mL,作为样品供试液备用。将复方苦豆子胶囊方中去掉决明子,同法制备和处理作为阴性对照液。另外称取大黄酚对照品5.0 mg,加甲醇适量使之溶解,定容于10 mL容量瓶中,制成0.5 mg/mL的对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,分别吸取上述3种溶液各6～10 μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶GF254薄层板上,以石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂,展距10 cm,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱图中,在与对照品相同位置上显橙黄色的荧光斑点,阴性对照品中无此斑点,说明供试品中有决明子成分而阴性对照品中无此成分。
2.1.3 苦豆子5 称取本品内容物3.0 g,研碎,置50 mL磨口锥形瓶中,加入氯仿25 mL,浓氨水2 mL,混匀,振摇3 min,放置过夜,将溶液转移至分液漏斗中,分取氯仿液,蒸干,残渣加氯仿1 mL使溶解,作为供试品溶液。将复方苦豆子胶囊方中去掉苦豆子,同法制备和处理作为阴性对照液。另取苦参碱对照品10 mg,置10 mL容量瓶中,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,配制成1 mg/mL的苦参碱对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,分别吸取上述3种溶液各4～10 μL,点于同一含0.5%羧甲基纤维素钠的硅胶G薄层板上,将薄层板置于层析缸中,饱和30 min,以氯仿-甲醇-浓氨水(5∶0.6∶0.3)为展开剂,展开约10 cm,取出,晾干,用改良碘化铋钾喷雾显色。供试品色谱图中,在与对照品相同位置上显相同橙黄色的斑点,阴性对照品中无此斑点,说明供试品中有苦豆子成分而阴性对照品中无此成分。
2.2 大黄酚含量测定
2.2.1 色谱条件 Thermo Hypersil-Gold色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水溶液(85∶15)；流速1.0 mL/min；检测波长254 nm；柱温：30 ℃；进样量20 μL。定量方法：外标峰面积法。在上述条件下,大黄酚保留时间约为6.24 min,主峰与杂质峰分离良好。
2.2.2 对照品溶液制备 精密称取大黄酚对照品1.42 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇制成浓度为142 μg/mL的溶液,作为对照品溶液,备用。
2.2.3 供试品溶液的制备 取装量差异检查项下的本品2.5 g,精密称定,置具塞磨口锥形瓶中,超声提取2次,滤过,合并提取液,蒸干,加1 mol/L盐酸溶液30 mL,于沸水中水解1 h,冷却,三氯甲烷剧烈振摇萃取3次,每次30 mL,合并三氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇溶解并定容至25 mL量瓶中,摇匀,溶液经0.45 μm滤膜滤过,作为供试品溶液[6]。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按制备工艺制备不含决明子药材的阴性样品,再按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
2.2.5 系统适用性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μL,分别注入液相色谱仪,进行测定。结果供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,有相同保留时间的色谱峰,而阴性对照在此保留时间无干扰(见图1)。图1 复方苦豆子胶囊HPLC图谱 注：A.对照品；B.阴性对照；C.供试品
2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下的对照品溶液(142 μg/mL)0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL,分别置于5 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,溶液经0.45 μm滤膜滤过。分别精密吸取20 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积。以对照品浓度(μg/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程：Y＝52.917X＋10.097(r＝0.999 7),大黄酚在0.028 4～0.908 8 μg范围内呈良好的线性关系。
2.2.7 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液,按上述色谱条件进行分析,重复进样6次,RSD＝1.6%(n＝6),表明仪器的精密度良好。
2.2.8 重复性试验 平行制备同一批样品的供试品溶液5份,照上述色谱条件进行测定,结果供试品中大黄酚的平均含量为0.884 mg/g,RSD＝1.5%(n＝6),表明本方法的重复性良好。
2.2.9 稳定性考察 精密吸取供试品溶液20 μL,分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样,测定峰面积,结果RSD＝0.88%。表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.10 加样回收率试验 称取已知含量的复方苦豆子胶囊(0.884 mg/g)1.25 g,精密称定,分别精密加入“2.2.2”项下相当于取样量中大黄酚含量80%、100%、120%的对照品溶液,照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定,计算回收率,结果见表1。表1 加样回收率试验结果
2.2.11 样品测定 取3批样品,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL,注入液相色谱仪,依法测定,每批平行测定3次,测得大黄酚平均含量为0.879 mg/g。
3 讨论
本试验参照有关文献对复方苦豆子胶囊处方中的山楂、决明子及苦豆子进行了TLC鉴别,结果表明,所建立的山楂、决明子、苦豆子的TLC鉴别方法专属性强,分离度好。
本试验曾对流动相甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)[7]、甲醇-水(85∶15)[8]、甲醇-水(90∶10)进行了比较,发现甲醇-水(85∶15)可使所测成分大黄酚达到基线分离,分离度大于1.5,峰形较好,保留时间适中,符合分析要求。故选择甲醇-水(85∶15)作为流动相。
文献表明,通常选择在25、30、40 ℃[9-11]条件下进行测定,本试验通过比较研究发现30 ℃时保留时间适中,且分离度、峰形均较好。故选择30 ℃为测定柱温。
有关决明子单味药及复方制剂中大黄酚含量测定的报道很多,本文首次报道了复方苦豆子胶囊中大黄酚含量测定的方法,为其质量控制提供了依据。
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(收稿日期：2009-09-23,编辑：陈静)