超高压水射流对葛根中葛根素含量的影响

【摘要】 目的研究超高压水射流对葛根有效成分葛根素的影响。方法通过150～350MPa不同压力的水射流处理葛根醇提液，采用薄层色谱法和高效液相色谱法定性鉴别和测定葛根的化学成分种类及含量变化。结果不同压力水射流处理葛根提取液后，葛根的薄层图谱中斑点个数、大小及Rf值无明显差别；葛根的液相图谱中峰个数及形状亦无明显差别，但经150～350 MPa压力的水射流处理后，葛根素的含量依次增加，尤其在350 MPa时葛根素的含量增加率达到5.68%。结论该研究可为超高压水射流对中药有效成分的影响提供基础实验数据，对科学加工处理和合理利用葛根药材有着重要的意义。

【关键词】  超高压水射流； 高效液相色谱法； 薄层色谱法； 葛根； 葛根素

　　Study on the Effect of Ultra High Pressure Water Jet on the Effective Components of Radix Puerariae

　　LIAO Yong, ZHANG Xiaorong, XU Bosan, WANG Shengmin, WANG Yiping, CHEN Bo

　　(College of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China;College of Pharmacology, Southwest Jiaotong University, E'mei 614202, China; 3.Dardi Corporation, Nanjing 211300, China)

　　Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of ultra high pressure water jet on the effective components puerarin of Radix puerariae. MethodsThe extraction of Radix puerariae was treated by various pressure from 150 MPa to 350MPa, components and contents was identified and determined by TLC and HPLC.ResultsThere were no obvious differences in the number, size and Rf value of spots on TLC chromatography, and basically the same on the number and shape of peaks on HPLC chromatograms between the solution treated under various pressure, but the content of puerarin in the solutions treated by 150 MPa to 300MPa was increased, particularly in the 350 MPa, the increasing rate of  puerarin content reached 5.68 percent.ConclusionThis investigation may provide some useful experimental information for the ultra high pressure water jet on the impact of the active ingredients of the Chinese medicine. It is very important for processing treatment and utilization of Radix puerariae.

　　Key words:Ultra high pressure water jet；  HPLC；  TLC；  Radix Puerariae；  Puerarin
   
　　超高压水射流技术是近几十年发展起来的一项新技术，它是指普通水经过超高压加压器，将水加压至100～400 MPa，根据加工需要，可加入金刚砂磨料，然后通过一个直径约为0.2 mm的细小宝石喷嘴，产生一道600～1 000 m/s的水箭，可用来切割各种材料，也可对各种物体表面进行清洗，甚至用来食品灭菌，以达到食品保鲜的目的［1］。葛根具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻功效，用于治疗外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、高血压颈项强痛等［2］，素有“亚洲人参”的美誉，是我国卫生部认定的药食同源植物［3］。现代研究证实，葛根中的主要有效成分为葛根素等异黄酮类化合物，具有抗炎解热、扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量的作用，同时也有降低血压的作用［4］。葛根素含量的高低，成为评价葛根药材及其制剂质量的重要指标。本文利用超高压水射流技术的瞬时卸压、高速撞击和高剪切等综合作用产生膨化的原理，研究该技术对葛根药材主要化学成分的影响，并探讨其主要有效成分发生变化的可能机理，为超高压水射流对中药有效成分的影响提供基础实验数据，为探索新的中药加工处理方法提供参考。

　　1  仪器与材料
   
　　LC-20AT高效液相色谱仪，包括LC-20AT泵、SPD-20A紫外检测器、AT-330柱温箱、Class-VP数据处理系统、7725i进样阀（日本岛津公司）；DPSB-3040型超高压水射流系统（南京大地水刀股份有限公司）。
   
　　葛根为市售，经本院王盛民教授鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata Ohwi的干燥根；葛根素对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号：110752-200511）；甲醇为HPLC级（美国Fisher公司）；所用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  供试品溶液的制备称取葛根药材粗粉约500 g，精密称定，10倍量80%的乙醇回流提取3次，2 h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，溶液定容至2 000 ml。量取葛根提取液200 ml，用超纯水稀释至20 L，分别在150，200，250，300和350 MPa压力条件下，经超高压水射流处理，将各溶液摇匀、静置，分别取未经处理和各处理液的上清液过0.45 μm微孔滤膜，标号为0，1，2，3，4，5号，作为供试品溶液。

　　2.2  对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品12.0 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀；精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（每毫升含葛根素96 μg）。

　　2.3  葛根的薄层色谱鉴别照薄层色谱法实验［2］，吸取“2.1”和“2.2”项制备的供试品溶液和对照品溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）为展开剂，展开，取出晾干，置日光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。斑点较为圆整，分离效果好，各供试品斑点大小及Rf值无显著差异。

　　2.4  HPLC色谱条件SymmetryC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（美国Waters）；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（25∶75）；检测波长250 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μl。在该色谱条件下，理论塔板数按葛根素峰计算不低于4 000，且样品中葛根素与其他组分分离良好，对照品及样品的色谱图见图1。

　　2.5  线性关系考察分别精密吸取“2.2”项下制备的葛根素对照品溶液2，4，6，8，10 μl进样测定，记录各峰面积。以葛根素进样量（μg）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，得回归方程Y=704 877.60X-653.88，r=0.999 9。结果表明葛根素在0.192～0.960 μg浓度范围内与峰面积有良好的线性关系。

　　2.6  精密度实验精密吸取葛根素对照品溶液10 μl，重复进样5次，测定峰面积，得RSD为1.65%。结果见表1。表1  精密度实验结果次序峰面积（略）

　　2.7  稳定性实验取“2.1”项未经超高压水射流处理的供试品溶液，同法分别于2，4，6，8，24 h测定，进样10 μl/次，结果RSD为1.37%，表明样品在24 h内稳定。结果见表2。表2  稳定性实验结果（略）

　　2.8  重复性实验取同一批样品粉末，按样品含量测定法同法测定5次，RSD为2.38%，表明该测定方法重复性比较好。结果见表3。表3  重复性实验结果（略）

　　2.9  加样回收实验采用加样回收法，称取已知含量的葛根药材5份，精密称定，再分别精密加入葛根素对照品溶液 （0.20 mg·ml-1）20 ml，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 μl，记录色谱图，结果葛根素平均回收率为96.1%，RSD为1.14%（n=5）。结果见表4。表4  葛根素回收率实验结果（略）

　　2.10  样品的测定精密吸取“2.1”项和“2.2”项下制备的供试品溶液和对照品溶液各10 μl分别进样5次，按上述色谱条件测定葛根素含量。结果见表5。表5  样品测定结果
样品号葛根素含量（略）

　　3  讨论
   
　　本文研究结果表明，不同压力的水射流处理葛根醇提液后，处理液的温度由进样温度19.8℃随压力的升高上升至51.8℃；葛根的薄层图谱中斑点的个数、大小及Rf值无明显差别；葛根的液相图谱中峰的个数及形状亦无明显差别，作为葛根药材的指标性成分葛根素，其含量均符合药典规定。经过150，200，250，300 和350 MPa不同压力水射流处理液中葛根素的含量都较原液升高，尤其以经350 MPa压力水射流处理液中葛根素含量最高，其原因可能是，由于葛根素本来就存在于葛根最外部的木栓层下的外部薄壁组织中，经过超高压水射流技术的瞬时卸压、高速撞击、高剪切和热协同作用产生膨化效应，破坏了药材中微生物的细胞壁及细胞膜，同时引发对压力敏感的非共价键（氢键、离子键、疏水键等）的破坏［5］，使得葛根素更容易浸出 。另外250 MPa以上的压力处理葛根溶液后，样品温度上升至45～52℃，且压力越大，温度越高，动态高压使葛根中的前体化合物发生降解反应，形成葛根素，综合作用的结果使葛根素含量较原液升高，压力越大，葛根素含量增加率越大。
   
　　通过超高压水射流对葛根液体制剂有效成分影响的研究，为探讨葛根药材在超高压水射流条件下有效成分的变化机理提供初步实验依据，对葛根药材资源的开发、利用有着重要的意义。

【参考文献】
  　　［1］区磊．超高压水射流技术的基本原理及应用［J］.机电信息，2003，7：21.

　　［2］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005:233.

　　［3］唐春红，陈琪．国内外葛根营养保健功能与开发现状［J］.中国食品添加剂,2002,6:56.

　　［4］李洪玉，戴诗文，寿旦，等.葛根中葛根素的高效液相色谱分析［J］.中国实用医药，2008，3（7）：7.

　　［5］王盛民．超高压水射流灭菌方法［P］.中国专利：CN1712071，2005-12-28.