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【摘要】 ：目的 建立止痢宁片的质量标准。方法 采用薄层色谱法对处方中的主要药味苦参、木香进行鉴别,并用高效液相色谱法测定其脱水穿心莲内酯的含量。结果 止痢宁片的苦参、木香薄层色谱中,在与对照品相应的位置上,显相同颜色的斑点；脱水穿心莲内酯进样量在0.062～1.550 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好(r＝1.000 0),平均加样回收率为98.00%(RSD＝0.90%)。结论 本方法简便、准确、稳定、可靠、重现性好,可用于本品的质量控制。
【关键词】 止痢宁片 质量标准 薄层色谱法 高效液相色谱法
Study on Method of Quality Control for Zhilining Pill
LI De-hua, LU Fang-jin, NI Yan
Shanxi Academy of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, Taiyuan 030012, China
Abstract：Objective To establish the quality standard for Zhilining pill. Methods TLC was employed to identify Radix Sophorae Flavescentis and Radix Aucklandiae while the content of dehydroandrographolide in Zhilining pill was detemined by HPLC. Results TLC findings of Radix Sophorae Flavescentis and Radix Aucklandiae showed the spots of same colors as those developed in the corresponding places of control medical materials. Good liner was observed when the samplesize of dehydroandrographolide was within the range of 0.062～1.550 μg (r＝1.000 0). The average recovery rate was 98.00% with RSD＝0.90%. Conclusion The method is simple, accurate, stable, reliable and with good reproducibility, which can be used for the quality control of Zhilining pill.
Key words：Zhilining pill；quality standard；TLC；HPLC
止痢宁片是由苦参、木香和穿心莲等组成的中药复方制剂,收载于部颁标准中,临床主要用于肠炎、痢疾,表现为腹痛泄泻、下痢脓血、肛门灼热、里急后重等的治疗。为了更好地控制产品质量,我们对其质量标准进行了研究,建立了处方中的主要药味苦参、木香的TLC鉴别方法,采用高效液相色谱法测定其脱水穿心莲内酯的含量,现介绍如下。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪：AgilentG1311A四元泵(Quatpump),Agilent G1322A真空在线脱气机(Degrasser), Agilent G1313A自动进样器(ALS),Agilent G1315B DAD二极管阵列检测器,Agilent chimstation system(安捷伦化学工作站)；电子天平(德国赛多利斯BP211D)；超声提取器；Milipore－Q纯水器。
止痢宁片自制(批号20060601、20060602、20060603)。三氯甲烷为分析纯；甲醇为色谱纯,美国天地(TEDIA)试剂公司；水为重蒸馏水。
对照品均由中国药品生物制品检定所提供：脱水穿心莲内酯对照品(含量测定用,批号110854-200306)；槐定碱(供鉴别用,批号0784-9702)；苦参碱(含量测定用,批号805- 200005)；木香烃内酯(含量测定用,批号111524-200503)；去氢木香内酯(含量测定用,批号111525-200505)。
2 定性研究
2.1 苦参薄层色谱鉴别
取本品5片,研细,取1 g,加浓氨试液0.3 mL、三氯甲烷25 mL,超声处理10 min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1 mL使溶解,作为供试品溶液。取缺苦参的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。另取苦参碱对照品、槐定碱对照品,分别加乙醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述4种溶液各5 μL,分别点样于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-浓氨(9∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点。
2.2 木香薄层色谱鉴别
取本品5片,研细,取1 g,加三氯甲烷10 mL,超声处理30 min,滤过,滤液作为供试品溶液。取缺木香的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。另取木香烃内酯对照品、去氢木香内酯对照品,分别加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述4种溶液各10 μL,分别点于同一含2.5%硝酸银的羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-丙酮(8∶1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性无干扰。
3 含量测定[1]
3.1 色谱条件
色谱柱为YWG C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：室温；流动相：甲醇-水(52∶48)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。在上述条件下,脱水穿心莲内酯的保留时间约为15 min；分离度大于1.5,理论塔板数大于4 000。
3.2 对照品溶液的配制
精密称取脱水穿心莲内酯标准品3.10 mg,置25 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
取止痢宁片适量,研细,取约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加甲醇25 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率33 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液10 mL,置中性氧化铝柱(100～200目,5 g,内径1.5 cm)上,用甲醇15 mL洗脱,收集洗脱液,置50 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,滤液作为供试品溶液。
3.4 阴性试验
制备缺少穿心莲提取物的止痢宁片阴性样品,按“3.3”项下方法操作制备阴性样品溶液。在“3.1”所述色谱条件下,对照品、样品及穿心莲阴性样品的色谱图见图1。结果表明,在该条件下,脱水穿心莲内酯的出峰区阴性样品无干扰峰。
3.5 线性关系考察
精密吸取脱水穿心莲内酯标准品溶液10 mL,用水稀释1倍(62 μg/mL),分别进样1、2.5、5、10、15、20、25 μL,依前法测定。以脱水穿心莲内酯的量(μg)为横坐标,峰面积值为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y＝1 359.5X＋0.315 4,相关系数r＝1.000 0。表明脱水穿心莲内酯在0.062～1.55 μg范围内进样量与峰面积值有较好的线性关系。
3.6 精密度试验
精密吸取“3.5”项所述对照品溶液10 μL,重复进样6次,结果峰面积值的RSD＝0.20%。
3.7 稳定性试验
按“3.3”项下方法制备溶液,分别在0、2.5、5、7、9.5、11.5 h进样,分别测定,记录峰面积积分值。结果表明,脱水穿心莲内酯峰面积在11.5 h内基本不变,RSD＝0.33%。
3.8 重复性试验
取同一批样品(批号20060601)5份,各约1 g,精密称定,分别按“3.3”项下方法操作,进行测定。结果脱水穿心莲内酯的平均含量为7.46 mg/g,RSD＝0.41%。
3.9 回收率试验
分别取已知含量的样品(批号20060601)5份,各约0.5 g,精密称定,分别精密添加脱水穿心莲内酯对照品3.71 mg,按“3.3”项下方法处理,按上述条件进行测定,结果见表1。表1 回收率试验结果（略）
3.10 样品测定
取止痢宁片3批,分别按“3.3”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进样测定,外标法定量,结果见表2。表2 止痢宁片含量测定结果(略)
4 讨论
在建立木香薄层色谱鉴别方法的过程中,曾参考药典方法,直接采用硅胶G薄层板进行层析,结果木香中的2个特征成分木香烃内酯、去氢木香内酯的Rf值小,两者分离度也较差。通过实验摸索,并结合成分结构特征,我们采用了络合薄层层析的方法,即用2.5%硝酸银溶液铺制薄层板进行层析[2],使两者得到了很好的分离,且重现性好。
在含量测定方法中,我们对供试品溶液制备的关键步骤进行了考察：①供试品超声时间的选择：对不同超声时间的样品回收率,以及药渣中脱水穿心莲内酯的含量进行了比较,确定超声30 min最佳。②最佳洗脱体积的选择：分别对10、15 mL甲醇洗脱后的柱子继续洗脱,检测其中的脱水穿心莲内酯,结果15 mL甲醇洗脱后没有检测出脱水穿心莲内酯,认为最佳洗脱体积为15 mL。
采用本试验供试品溶液制备方法,结果脱水穿心莲内酯提取效率高,样品的回收率较为满意,而且操作简单、灵敏、重现性好,可以用来对止痢宁片中脱水穿心莲内酯的含量进行测定。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.附录ⅥD,190.
[2] 王战国,赖先荣,肖莹莹,等.川木香质量标准研究[J].成都中医药大学学报,2006,29(1)：54－56.