水飞蓟素制剂中有效成分HPLC分离测定

摘要目的：建立一种用HPLC分离测定Legalon胶囊、益肝灵片、复方益肝灵片中水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭、水飞蓟宁含量的方法。
方法：以Shim-Pack VP-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm）及预柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）为分析柱。甲醇与混合溶剂水-二氧六环(9∶1）按梯度洗脱为流动相，流速为1.5 mL^.min^-1，检测波长为288 nm，柱温为40 ℃。
结果：样品中各组分的平均回收率分别为水飞蓟亭99.66％，水飞蓟宁99.48％，水飞蓟宾100.0％，异水飞蓟宾98.72％。
结论：该法同时测定4个主要有效成分的含量，便捷、灵敏、准确。

Separation and Determination of Effective Component
in Compound Products of Silymarin by HPLC

Ding Tianming and Shi Yunhua
(Hubei Institute for Drug Control, Wuhan 430064)
Tian Songjiu, Gu Daozhao and Sun Zengpei
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing　100050)
Zhang Zhengxing
(China Pharmaceutical University, Nanjing　210009)

AbstractObjective：A HPLC method in the separation and determination of Silybin，Isosilybin，Silydianin and Silycristin in Legalon，Yiganling tablets and Compound Yiganling tablets was developed.
Method:In the method Shim-pack VP-ODS(150 mm×4.6 mm,5 μm) and(10 mm×4.6 mm,5 μm)as the column and methanol and solvent mixture water-dioxane(9∶1)by gradient as the mobile phase and the flow rate of 1.5 mL^.min^-1 and column temp.of 40 ℃were adopted and the detection wavelength of 288 nm was specified.
Results:The average recovery of 99.66％ for Silycristin,99.48％ for Silydianin，100.0％ for Silybin and 98.72％ for isosilybin is respectively obtained.
Conclusion:The method is convient，sensitive and actuate.
Key words　HPLC，Silymarin，Silybin，Isosilybin，Silydianin，Silycristin，compound products

　　水飞蓟素是从水飞蓟 （ Silybum mari-anum L.Gaertn.）干燥果实中提取分离出的用于治疗肝胆疾病的一类新型具有C₉取代基的黄酮类化合物，其主要有效成分为水飞蓟宾（Silybin）、异水飞蓟宾（Isosilybin）、水飞蓟宁（Silydianin）和水飞蓟亭（Silycristin）。水飞蓟素中水飞蓟宾和异水飞蓟宾的分离测定偶见报道^［1，2］，许多研究者对水飞蓟宾和异水飞蓟宾均未分离测定^［3～6］，至于水飞蓟素制剂中4个主要有效成分同时分离测定均未见报道。本文采用HPLC分离测定德国Legalon胶囊以及国内益肝灵片和复方益肝灵片中水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁及水飞蓟亭的含量，该法快捷、灵敏、准确。

1　仪器与试药
高效液相色谱仪：Shimadzu LC—10AT VP。
水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁及水飞蓟亭对照品（德国MADAUS AG 和中国药品生物制品检定所提供）；样品：Legalon胶囊（德国MADAUS AG 提供），益肝灵片（市售），复方益肝灵片和复方益肝灵片的阴性空白粉末（北京制药工业研究所实验药厂）；甲醇（色谱纯），重蒸水，其它试剂为分析纯。

2　色谱条件
分析柱：Shim-pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm，5 μm）；预柱：10 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：梯度 溶剂A为甲醇，溶剂B为水－二氧六环（9∶1）混合溶剂(见图1)。总流速：1.5 mL^.min^-1，检测波长：288 nm，柱温：40 ℃。

图1　流动相的梯度图

3　实验方法
3.1　选择性实验　
Legalon是德国水飞蓟素原料单味胶囊剂，益肝灵片是国产水飞蓟素原料单味片剂，二者按样品测定法制备溶液，进样10 μL，色谱图中除4个成分的峰面积比例不一致外,保留时间一致。复方益肝灵片是由水飞蓟素与五仁醇浸膏组成的片剂，将缺水飞蓟素的阴性空白粉末按样品测定法制备溶液，另取水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁及水飞蓟亭对照品制成甲醇混合溶液，各进样10μL，阴性对照溶液色谱没有干扰。见图2。

图2　高效液相色谱图
A.混合对照品溶液　B.阴性对照溶液　C.国产水飞蓟素样品溶液　D.进口水飞蓟素样品溶液
1.水飞蓟亭　2.水飞蓟宁　3，4.水飞蓟宾非对映异构体　5，6.异水飞蓟宾非对映异构体

3.2　线性关系的考察　
精密称定水飞蓟宾14.37 mg、异水飞蓟宾8.85 mg、水飞蓟宁8.46 mg、水飞蓟亭13.98 mg，分别加甲醇溶于10 mL容量瓶中，超声处理20 min，冷却后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。精密量取上述对照品溶液各0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，各进样10 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程见表1。

表1　回归方程与线性范围（n=6）

成分

回归方程

r

线性范围／μg

水飞蓟亭

Y＝1397620X－10198

0.9996

0.1398～1.398

水飞蓟宁

Y＝755927X＋8791

0.9993

0.0846～0.846

水飞蓟宾

Y＝1625519X－88924

0.9996

0.1437～1.437

异水飞蓟宾

Y＝1228090X＋21931

0.9996

0.0885～0.885

3.3　稳定性试验　
取复方益肝灵片样品溶液（批号为981007）在0，0.5，1，2，4 h分别进样10 μL，记录峰面积，结果峰面积的RSD分别为水飞蓟亭1.2％、水飞蓟宁1.0％、水飞蓟宾0.7％、异水飞蓟宾0.8％，可见供试品溶液稳定。
3.4　精密度试验　
取样品测定项下对照品甲醇混合溶液重复进样5次，对照品峰面积积分值的RSD分别为水飞蓟亭0.7％、水飞蓟宁0.8％、水飞蓟宾0.9％、异水飞蓟宾0.8％。
3.5　重复性试验　
取样品Legalon(Batch 821055) 8，10，12 mg各3份，按样品测定法测定，结果每片含水飞蓟亭22.8 mg(RSD=0.8％)、水飞蓟宁28.4 mg(RSD=0.9％)、水飞蓟宾50.1　mg(RSD= 0.7％)、异水飞蓟宾22.2 mg(RSD=0.8％)。
3.6　回收率试验
3.6.1　空白回收试验　
取复方益肝灵片的阴性对照空白粉末0.2 g，置100 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，使溶解放冷后，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液1 mL共10份，置10个10 mL容量瓶中，其中1份为空白样品，另9份分别加入混合对照品溶液(含水飞蓟亭、水飞蓟宁、水飞蓟宾、异水飞蓟宾分别为0.256，0.322，0.851，0.374 mg^.mL^-1)0.8，1.0，1.2 mL各3份，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各进样10 μL，照样品测定法的色谱条件，记录色谱图，计算回收率，见表2。

表2　回收率试验结果(n=9)

成分

加入量／μg

测得量／μg

回收率／%

RSD／％

水飞蓟亭

0.2048～0.3072

0.1984～0.3125

96.88～101.7

＜3.4

水飞蓟宁

0.2576～0.3864

0.2523～0.3860

97.94～99.10

＜1.4

水飞蓟宾

0.6808～1.021

0.6825～1.015

100.2～99.41

＜0.56

异水飞蓟宾

0.2992～0.4488

0.2945～0.4429

98.43～98.69

＜0.72

3.6.2　Legalon加样回收试验　
精密称定Legalon(Batch 825121)49.35 mg内容物，置100 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，使溶解，放冷后，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 mL共10份，置10个10mL容量瓶中，其中1份为空白样品，另9份分别加入混合对照品溶液(含水飞蓟亭、水飞蓟宁、水飞蓟宾、异水飞蓟宾分别为0.256，0.322，0.851，0.374 mg*mL^-1) 0.8，1.0，1.2 mL各3份，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各进样10 μL，照样品测定法的色谱条件，记录色谱图，计算回收率，见表3。

表3　Legalon加样回收率试验结果(n=9)

成分

样品量／μg

加入量／μg

测得量／μg

回收率／%

RSD／％

水飞蓟亭

0.1591

0.2048～0.3072

0.3620～0.4610

99.48～98.86

＜0.52

水飞蓟宁

0.1968

0.2576～0.3864

0.4501～0.5844

99.05～100.2

＜1.3

水飞蓟宾

0.3594

0.6808～1.021

1.020～1.360

98.08～98.55

＜0.35

异水飞蓟宾

0.1550

0.2992～0.4488

0.4592～0.6115

101.1～101.3

＜0.38

3.6.3　益肝灵片加样回收试验　
精密量取益肝灵片(批号 980409)样品的测定液5 mL共10份，置10个10 mL容量瓶中，其中1份为空白样品，另9份分别加入混合对照品溶液(含水飞蓟亭、水飞蓟宁、水飞蓟宾、异水飞蓟宾分别为0.256，0.322，0.851，0.374 mg*mL^-1)0.8，1.0，1.2 mL各3份，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各进样10 μL，照样品测定法的色谱条件，记录色谱图，计算回收率，见表4。

表4　益肝灵片加样回收率试验结果(n=9)

成分

样品量／μg

加入量／μg

测得量／μg

回收率／%

RSD／％

水飞蓟亭

0.1807

0.2048～0.3072

0.3867～0.4867

100.3～99.75

0.52

水飞蓟宁

0.0583

0.2576～0.3864

0.3199～0.4404

101.3～99.03

1.3

水飞蓟宾

0.4196

0.6808～1.021

1.108～1.463

100.7～101.6

0.65

异水飞蓟宾

0.1166

0.2992～0.4488

0.4201～0.5699

101.0～100.8

0.48

4　样品测定
4.1　Legalon样品溶液的制备　
取本品20粒，精密称定平均装量，并精密称取内容物适量（约10 mg），置10 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，使溶解，放冷后，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
4.2　益肝灵片样品溶液制备　
取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取粉末适量（约150 mg），置100 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，使溶解，放冷后，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
4.3　复方益肝灵片样品溶液制备　
取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取粉末适量（约450 mg）置100 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，使溶解，放冷后，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
4.4　对照品溶液的制备　
精密称取减压干燥至恒重的各对照品，加甲醇制成每1 mL含水飞蓟亭25.6 μg、水飞蓟宁32.2 μg、水飞蓟宾85.1 μg、异水飞蓟宾37.4 μg的甲醇混合溶液。
4.5　测定结果　
分别精密吸取对照品混合溶液与样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，以外标法计算样品中各组分的含量，见表5。

表5　样品的测定结果(mg每片或每粒，n=3)

样品

批号

水飞
蓟亭

水飞
蓟宁

水飞
蓟宾

异水飞
蓟宾

Legalon

821055

23.0

28.3

48.9

22.3

825121

23.3

28.8

52.7

22.7

830153

23.2

27.5

53.6

19.5

益肝灵片

980409

6.2

2.0

14.4

4.0

980411

6.1

2.0

13.4

4.0

980412

6.3

1.8

14.3

3.9

复方益肝灵片

981007

2.3

1.6

5.3

2.1

980825

2.4

1.8

5.4

2.2

981016

2.4

1.7

5.7

2.1

5　讨论
5.1　Legalon胶囊为德国MADAUS AG产品，原标准采用比色法测总黄酮的量，且采用HPLC测水飞蓟宾的含量。益肝灵片和复方益肝灵片为部颁标准品种，分别采用分光光度法和吸收系数法测总黄酮的量^［5，6］。
5.2　水飞蓟宾与异水飞蓟宾在上述色谱条件下被分别分离成二峰，为水飞蓟宾和异水飞蓟宾的非对映异构体，结构如下：

水飞蓟宾的非对映异构体

异水飞蓟宾的非对映异构体

　　因此，水飞蓟宾的2个非对映异构体相加作为水飞蓟宾定量指标。异水飞蓟宾的2个非对映异构体相加作为异水飞蓟宾的定量指标。
5.3　曾选择混合溶剂0.05 mol^.L^-1磷酸甲醇四氢呋喃(75∶18∶7）与甲醇作为流动相系统按一定的梯度进行洗脱。色谱图中，水飞蓟宁与水飞蓟亭分离效果不好，水飞蓟宾与异水飞蓟宾能分开，但水飞蓟宾有一肩峰。经选择性试验，本文所采用的色谱条件为最佳，使用梯度有利于水飞蓟宁与水飞蓟亭的分离，同时还能缩短总的保留时间。在其它色谱条件不变时水与二氧六环的比例以9∶1经试验为最佳。
5.4　经过对进口样品与国产样品的分析，发现水飞蓟素中4种有效成分的比例不同。进口水飞蓟素中水飞蓟亭-水飞蓟宁-水飞蓟宾-异水飞蓟宾(0.46∶0.56∶1∶0.44)，而国产水飞蓟素中其比例为0.43∶0.25∶1∶0.28。国产水飞蓟素中水飞蓟宁的含量比例较进口水飞蓟素中水飞蓟宁的含量低1倍多。可能是因为地理、气候等因素的原因。

作者单位：定天明 施蕴华 湖北省药品检验所 武汉430064
田颂九 谷道昭 孙曾培 中国药品生物制品检定所 北京100050
张天行 中国药科大学 南京210009

参考文献
1　Mascher H,Kikuta C,Weyhenmeyer R. Diastereoisomeric separation of free and conjugated silybin in plasma by reversed phase HPLC after specific extraction.J Liq Chromatogr, 1993,16(13):2777
2　Rickliug B,Hans B,Kramarczyk R, et al. Two high-performance liquid chromatographic assays for the determination of free and total silybinin diastereomers in plasma using column switching with electrochemical detection and reversed-phase chromatography with uLtraviolet detection .J Chromatogr B, 1995,13: 670
3　Martinelli EM,Morazzoni P,Livio S,et al. Liquid chromatographic assay of silybin in human plasma and urine.J Liq Chromatogr,1991,14(7): 1285
4　吴知行，张时行，徐丽蓉等.水飞蓟宾及其水溶性衍生物和制剂含量测定方法的研究.南京药学院学报,1981,17(2):28
5　中华人民共和国卫生部药品标准.1993.154
6　中华人民共和国卫生部药品标准.1997.126

收稿日期:1999-07-15