RP-HPLC法测定注射用脂质体两性霉素B中两性霉素B的含量

摘要目的：建立用反相高效液相色谱法测定注射用脂质体两性霉素B中两性霉素B含量的方法。
方法：采用Hypersil BDS C₈柱，0.01 mol^.L^-1磷酸二氢钾-乙腈(67∶33)为流动相，检测波长405 nm。
结果：两性霉素B在5～50 μg^.mL^-1浓度范围内呈现良好的线性关系(r=0.9999)，平均回收率为100.3%，RSD=0.83%(n=4)。
结论：本法操作简单，准确，易行。

RP-HPLC Determination of Amphotericin B in Amphotec

Lin Ling and Li Zixiong
(Guangzhou Institute for Drug Control,Guangzhou 510160)

AbstractObjective：A RP-HPLC method was developed for the determination of Amphotericin B in Amphotec.
Method:In the method,Hypersil BDS C₈ as the stationary phase,and 0.01 mol^.L^-1 monobasic sodium phosphate-acetonitrile(67∶33)as mobile phase,detected at 405 nm.
Results:Within 5～50 μg^.mL^-1,Amphotericin B had a good linearity(r=0.999 9).The average recovery of Amphotericin B was 100.3%,with RSD was 0.83%(n=4).
Conclusion:The method is simple,accurate and easy to do.
Key words　RP-HPLC,Amphotericin B

　　两性霉素B(AmB)是由结节链霉菌产生的大分子多烯类抗生素，是临床上治疗深部真菌感染的首选药物，也是唯一可作静脉滴注的多烯类抗生素。但由于它的高毒性^［1，2］，在临床上的应用受到极大的限制。因此，在70年代末、80年代初，各国的学者通过将AmB包埋入脂质体材料或同其它脂质载体结合形成新的AmB剂型^［1］，以改变AmB在体内的代谢和分布而达到提高疗效降低毒性的目的。注射用脂质体两性霉素B是由两性霉素B与胆固醇酰硫酸钠以1∶1的摩尔比混合形成的复合物，是由美国Ben Venue公司生产的一种注射用两性霉素B新剂型，这种两性霉素B新剂型，国内外药典尚未收载。测定两性霉素B的方法，有微生物效价法^［3～5］、HPLC法^［6，7］，国内尚未见有采用HPLC法测定两性霉素B含量的报道，本文采用RP-HPLC法测定注射用脂质体两性霉素B中两性霉素B的含量，方法简单易行。

1　仪器和试剂
岛津LC—10A高效液相色谱仪；岛津SPD—10A紫外可见分光光度检测器，CBM—10A数据处理机；CTO—10A柱恒温箱等。
注射用脂质体两性霉素B(每瓶含两性霉素B 100 mg，胆固醇酰硫酸钠52.8 mg)及两性霉素B对照品均由美国Ben Venue公司提供；乙腈为色谱纯；磷酸二氢钾和甲醇均为分析纯。

2　色谱条件
色谱柱：Hypersil BDS C₈(5 μm,4.6 mm×200 mm)不锈钢柱；流动相：0.01 mol^.L^-1磷酸二氢钾-乙腈(67∶33)；流速：1.2 mL^.min^-1；检测波长：405 nm；进样量：20 μL。两性霉素B在上述色谱条件下的色谱图见图1。

图1　两性霉素B色谱图
1.两性霉素B(5.7 min)

3　实验条件选择
3.1　流动相pH对色谱行为的影响　
配制0.01 mol^.L^-1磷酸二氢钾溶液，测定其pH为4.6，用稀氢氧化钾溶液调节pH分别为5.0和5.6，考察不同pH的流动相对色谱行为的影响，结果表明流动相中0.01 mol^.L^-1磷酸二氢钾溶液的pH在4.6～5.6时对色谱行为影响不大，均可将两性霉素B峰与杂峰分开，因此可直接选用0.01 mol^.L^-1磷酸二氢钾溶液为流动相。
3.2　乙腈含量对色谱行为的影响　
分别配制乙腈比例为40%，33%，30%的流动相，考察乙腈含量对色谱峰的影响。结果表明，流动相中乙腈含量对主峰影响较大，乙腈比例为40%时，主峰保留时间减少，两性霉素B主峰与杂峰不能完全分开；乙腈比例为30%时，主峰保留时间延长，峰形变差，柱效降低，故采用乙腈比例为33%的流动相较为适宜。
3.3　检测波长的选择　
注射用脂质体两性霉素B中除含两性霉素B外，还含有另一主成分胆固醇酰硫酸钠，两性霉素B在405 nm波长处有最大吸收，而后者则无吸收，选择405 nm波长，胆固醇酰硫酸钠不干扰两性霉素B含量测定。

4　测定方法与结果
4.1　线性范围　
　　精密称取两性霉素B对照品约25 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为250 μg^.mL^-1的对照品贮备液。精密量取该溶液适量，用流动相稀释成浓度分别为5，10，20，30，40，50 μg^.mL^-1的溶液，分别进样20 μL，以峰面积为纵坐标，以浓度(μg^.mL^-1)为横坐标，计算其回归方程(n=6)为:

Y=41 238.3X+17 122.6　r=0.999 9

结果表明：两性霉素B在5～50 μg^.mL^-1浓度范围内呈现良好线性关系。
4.2　加样回收试验　
精密称取两性霉素B对照品10 mg各4份，分别置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液各5 mL，分别置50 mL量瓶中，精密加入样品液(10 μg^.mL^-1)5 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述溶液各20 μL进样，测定两性霉素B含量，除去样品本底，按外标法计算回收率，回收率分别为101.1%，100.8%，99.9%，99.3%，平均回收率为100.3%，RSD为0.83%(n=4)。
4.3　精密度试验　
取加样回收试验项下同一份供试液，重复进样4次，RSD为0.79%。
4.4　含量测定　
取本品10瓶，分别精密加水20 mL溶解，摇匀。精密量取2 mL置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，再精密量取该溶液5 mL置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度。分别取该溶液20 μL进样，测定两性霉素B含量，并与药典的微生物效价法^［3］比较，3批注射用脂质体两性霉素B中两性霉素B的含量结果见表1。

表1　两性霉素B含量测定结果(标示%)

批号

本法

微生物效价法

7AMP-5

100.4

103.0

7AMP-6

104.0

104.2

7AMP-7B

102.0

105.4

4.5　稳定性试验　
取含量测定项下供试液，分别于室温放置0，1，3，5 h后进样，结果4次测定的平均值为102.4%，RSD为0.62%。

5　讨论
5.1　用RP-HPLC法和微生物效价法测定两性霉素B含量，两法的结果经成对数据的t检验处理，两组结果无显著差别(见表1)，RP-HPLC法操作简单，准确，快速，是两性霉素B含量测定的一种新方法；微生物效价法操作繁琐，测定时间较长，且影响因素较多，用啤酒酵母菌(9763)测定，抑菌圈清晰度较难掌握，对测定结果有一定影响。
5.2　稳定性试验结果表明，样品溶液立即测定与放置5 h后测定的相对标准差在测定误差范围内，供试液在5 h内是稳定的。另外，将样品溶液稀释后分别放置0，1，2，4 h后进样与放置0，1，2，4 h后才稀释进样，比较两者的测定结果，前者4次测定的平均值为102.1%，RSD为0.51%，后者4次测定的平均值为102.5%，RSD为0.66%，说明样品溶解后只要避光保存，在一定时间内是稳定的。
5.3　本品加水溶解时，会产生大量的气泡，经放置2 h气泡仍无法完全自动消失，影响定容，此时可加入数滴乙腈降低溶液表面张力，气泡立即消失。

作者单位：广州市药品检验所 510160

参考文献
1　顾觉奋，郑珩.两性霉素B的新型制剂及其作用机制.国外医药抗生素分册，1996，17(5)：363
2　马慕良.两性霉素B脂质体和脂质体复合物的临床应用.国外医药抗生素分册，1996，17(4)：289
3　中国药典.1995.二部：273
4　BP.1993.Volume I:45
5　USP.Ⅹ　.105
6　Michel Margosis，Adorjan Aszalos.Quantitation of amphitericins by reverse-phase high-performance liquid chromatography.J Pharm Sci,1984,73(6):835
7　Patrick M Kelly.Separation of amphotericin B components by combined thin-layer and high-performance liquid chromatography.J Chromatogr,1988,437:221

收稿日期:1998-08-17