高效液相色谱法测定十大功劳属植物中的7种生物碱成分

　　十大功劳属(Mahonia)植物在我国约有50种，分布于南方各地。该属植物主要以根、茎入药，称“刺黄连、刺黄柏、功劳木”等；有的地区以叶入药，称“功劳叶”^［1，2］。有的用作提取“黄连素”、异汉防己甲素(isotetrandrine)的原料。已从该属植物中发现20多种苄基异喹啉类生物碱，其中双苄基异喹啉类的尖刺碱(oxyacanthine,Ⅰ)、小檗胺(berbamine,Ⅱ)、异汉防己甲素(Ⅴ)和原小檗碱类的小檗碱(berberine,Ⅶ)、药根碱(jatrorrhizine,Ⅳ)、巴马亭(palmatine,Ⅵ)、非洲防己胺(columbamine,Ⅲ)等成分分布广泛，含量较高。现代药理实验和临床应用结果表明，这些成分具有抗菌、消炎、抗病毒、降血压、降血脂、抗心率失常、抗血小板聚集、抗衰老、镇痛等生理活性^［3～11］。
对十大功劳属植物中生物碱成分测定的文献报道较少。有文献报道用薄层扫描法测定大叶刺黄柏中的Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ^［12］；用薄层光密度法测定4种十大功劳属植物茎中的Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、木兰花碱(magnoflorine)^［13］；用高效液相色谱法测定十大功劳叶中的Ⅶ^［14］。作者在用变波长高效液相色谱法测定了小檗属(Berberis)植物根中的生物碱的基础上^［15］，为了开发利用十大功劳属植物资源，建立了高效液相色谱法测定十大功劳属植物中的Ⅰ～Ⅶ的方法。这7种成分可用203 nm固定波长1次检测，也可用203～346nm变波长2次检测。但后者既使7种待测成分在各自的最大吸收波长处检测，又避免了吸收波长不同的相邻色谱峰的干扰，提高了分析的灵敏度和准确度。本文用变波长高效液相色谱法对我国产的十大功劳属3种植物的根、根皮、根木、茎皮、茎木和10种不同产地的植物根中的Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ进行了定量分析，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ因对照品量少，只做了定性分析。

1　仪器与试药
Waters高效液相色谱仪(510型泵，490E检测器，U6K进样器，Baseline 810色谱工作站)。
对照品：盐酸小檗碱、盐酸巴马亭、盐酸药根碱购于中国药品生物制品检定所；非洲防己胺由中国药品生物制品检定所涂国士研究员赠送；小檗胺购于中国科学院林业土壤研究所，经重结晶纯化；尖刺碱、异汉防己甲素由中国医学科学院药用植物研究所提供(所用对照品经硅胶薄层层析、2种溶剂系统展开为单点；高效液相色谱法测定，主成分的峰高、峰面积均在97%以上)。植物标本由中国科学院植物研究所应俊生研究员鉴定。乙腈为色谱纯，甲醇和磷酸二氢钾为分析纯，去离子水。

2　实验方法及结果
2.1　色谱条件^［15］　
色谱柱：μ-Bondapak phenyl(10μm，3.9mm×300mm，美国Waters公司)；流动相：0.02mol^.L^-1磷酸二氢钾-乙腈(7∶3)；柱温：室温；流速：1.0mL^.min^-1；灵敏度：0.08AUFS；检测波长：固定波长用203nm，变波长0.0～10.0min用203nm，10.0min以后用346 nm。7种生物碱对照品的色谱图见图1。

图1　7种生物碱对照品的色谱图(203 nm检测)
Ⅰ.尖刺碱　Ⅱ.小檗胺　Ⅲ.非洲防己胺Ⅳ.药根碱　
Ⅴ.异汉防己甲素　Ⅵ.巴马亭　Ⅶ.小檗碱

2.2　回归方程及线性范围　
按文献［15］，以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积(microvolt-sec)为纵坐标(Y)，求得回归方程见表1。
2.3　样品溶液的制备　
精密称取干燥样品粉末0.1g于50mL磨口三角瓶中，加甲醇20mL，称重，浸泡12h，超声提取60min，称重，补足损失的甲醇，摇匀，密闭，静置；取5.0mL上清液于离心管中，密闭，离心(10000r^.min^-1，10min)；取上清液(2.0mL)作为样品溶液。

表1　4种生物碱定量分析的回归方程和线性范围

成分

回归方程

r

线性范围/μg

Ⅱ

Y=9.017X×10⁴+4.318×10⁵

0.9993(n=7)

0.019～0.296

Ⅳ

Y=4.239X×10⁴-8.228×10⁴

0.9999(n=9)

0.019～0.996

Ⅵ

Y=4.191X×10⁴+1.446×10⁵

0.9998(n=9)

0.020～1.008

Ⅶ

Y=4.209X×10⁴+1.278×10⁵

0.9998(n=9)

0.020～1.010

2.4　精密度试验^［15］　
精密吸取一样品溶液10μL进样，重复测定10次。求得样品中各成分浓度(μg^.mL^-1)的RSD(%)：小檗胺 0.28，药根碱 0.84，巴马亭 0.75，小檗碱 1.21。
2.5　加样回收率试验　
分别精密称取狭叶十大功劳茎的干燥粉末0.05g5份于50mL磨口三角瓶中，按文献［15］操作，每份重复测定3次；计算Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ的回收率，分别为97.2%～102.1%、98.9%～100.3%、97.2%～100.1%、99.4%～100.1%，RSD分别为2.0%、0.62%、1.3%、0.30%。
2.6　样品分析^［15］　
精密吸取样品溶液10μL进样，用203～346nm变波长检测，对Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ进行了定量分析，对Ⅰ、Ⅲ定性分析。再精密吸取10μL进样，用203nm固定波长检测，得到各样品的特征图谱，并定性分析成分Ⅴ。对十大功劳属3种植物的根、根皮、根木、茎皮、茎木和10种不同产地的植物根中的7种生物碱的分析结果见表2、3。

3　讨论
3.1　本文建立的方法能在同一个色谱条件下25min

表2　3种十大功劳属(Mahonia)植物不同部位7种生物碱分析结果(%，n=2)

植物名称

部位

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

Ⅴ

Ⅵ

Ⅶ

甘平十大功劳 Mahonia eurybracteata Fedde subsp.ganpinensis(H.Leveill)T.S.Ying et Boufford
(四川省中药学校)

根

-

±

+

0.68

+

0.05

0.78

根皮

+

0.01

-

1.66

+

0.14

3.76

根木

+

±

+

0.69

+

0.06

0.84

茎皮

-

±

-

0.34

+

0.05

0.47

茎木

+

±

-

0.53

+

0.08

0.21

狭叶十大功劳 M.fortunei(Lindl.)Fedde
(重庆南川药物种植所)

根

+

0.34

+

1.17

+

0.06

1.27

根皮

+

0.98

+

3.02

+

0.20

3.54

根木

+

0.18

+

0.54

+

±

0.70

茎皮

+

0.29

+

1.47

+

0.19

0.41

茎木

+

0.28

+

0.98

+

0.05

1.36

长苞十大功劳 M.longibracteata Takeda
(四川峨边)

根

+

±

+

0.40

+

0.62

1.73

根皮

+

±

+

1.10

+

1.30

6.94

根木

-

±

+

0.33

+

0.80

0.98

茎皮

-

±

+

0.74

-

0.60

1.24

茎木

-

-

+

0.21

-

0.28

0.45

　　+：检出该成分　-：未检出该成分　±：含量＜0.01%

表3　10种十大功劳属(Mahonia)植物根中7种生物碱分析结果(%，n=2)

植物名称

产地

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

Ⅴ

Ⅵ

Ⅶ

阔叶十大功劳 Mahonia bealei(Fort.)Carr.

四川峨边

+

±

+

0.44

+

0.78

1.44

重庆奉节

+

0.02

+

0.50

+

0.64

2.07

鼠刺十大功劳 M.bodinieri Gagnep.

重庆金佛山

+

0.10

+

0.81

+

0.09

0.77

重庆药物种植所

+

0.08

+

0.79

+

0.06

1.11

重庆中药研究院

+

±

+

0.41

+

0.05

0.78

湖南新化^*

+

±

+

0.16

+

0.53

1.44

川鄂十大功劳M.eurybracteata Fedde subsp.eurybracteata

四川峨眉山

-

±

+

0.45

+

0.14

1.10

四川峨边

-

±

+

0.82

+

0.12

1.22

重庆缙云山

+

±

+

0.35

+

0.02

0.73

甘平十大功劳 M.eurybracteata Fedde subsp.ganpinensis(H.Leveill)T.S.Ying et Boufford

重庆南川

+

0.01

+

1.01

+

0.04

1.58

四川省中药学校

-

±

+

0.68

+

0.05

0.78

狭叶十大功劳 M.fortunei(Lindl.)Fedde

重庆药物种植所

+

0.34

+

1.17

+

0.06

1.27

四川峨眉山

+

±

+

0.82

+

0.06

1.42

湖南新化^*

+

0.19

+

0.88

+

0.07

0.59

细梗十大功劳 M.gracilipes(Oliv.)Fedde

四川峨眉山

-

±

+

0.67

+

0.15

0.99

长苞十大功劳M.longibracteata Takeda

四川峨边

+

±

+

0.40

+

0.62

1.73

岩紫黄 M.nitens Schneid.

四川峨眉山

-

0.02

+

1.05

+

0.17

0.55

多齿十大功劳 M.polyodota Fedde

四川峨眉山

-

0.02

+

0.67

+

0.10

0.52

重庆金佛山

-

0.01

+

0.22

+

0.13

0.30

M.sp.(未定种名)

重庆金佛山

-

0.01

+

0.28

+

1.38

1.30

　　+：检出该成分　-：未检出该成分　±：含量＜0.01%　*：测定部位是茎

内测定十大功劳属植物不同部位以及不同产地植物中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ 3种双苄基异喹啉类和Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ 4种原小檗碱类生物碱。方法的重现性好、精密度高、适用范围广。
3.2　十大功劳属与小檗属植物亲缘关系相近，化学成分相似。研究结果表明：能用相同或相近的HPLC色谱条件测定这两属植物中相同的生物碱成分。
3.3　在所测定的10种植物中，Ⅲ的峰很低，参照Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ的分子结构和峰面积，推测Ⅲ的含量低于0.01%。Ⅰ和Ⅱ除狭叶十大功劳外，在其余植物中的峰较弱，含量较低；Ⅴ的峰在大多数植物中很强，含量高(本实验中因对照品量少，未定量)。
3.4　这7种成分在该属植物不同部位中的分布、含量有一定差别，其差异程度随植物种类不同而异。含量基本上以根皮中最高，茎皮中次之，然后是根木部、茎木部。以往多以茎入药^［1］，但从分析结果看，其根也是不可忽视的资源。

作者单位：吕光华　华西医科大学药学院 成都610044
王立为 陈立民 肖培根　中国协和医科大学、中国医学科学院药用植物研究所 北京100094

参考文献
1　中国药典.1995.一部：68
2　江苏新医学院.中药大辞典(上册).上海：上海科学技术出版社，1986.22
3　国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册.北京：人民卫生出版社，1986.119，120，238，631，637，794，800
4　谢义明.小檗碱的药理研究及临床应用.中国医院药学杂志，1991，11(12)：538
5　彭源贵.抗心律失常植物药研究概况.中草药，1988，19(7)：39
6　董会奕，姚棕.异汉防己甲素治疗高血压临床研究.中西医结合杂志，1991，11(2)：87
7　刘慰庸，魏新月，董爱玲.异甲防己素的系统药理实验研究　Ⅱ.镇痛作用的实验研究.贵阳医学院学报，1987，12(2)：117
8　黄伟民，李宝珍，阎徐均等.黄连素抗血小板聚集作用与基础研究.中华血液学杂志，1989，10(5)：228
9　刘昌孝，刘国声，肖培根.国内小檗胺研究的进展.中草药，1983，14(1)：45
10　陈超，韩虹，方达超.药根碱对实验动物心肌缺血和复灌性损伤的保护作用.中国药理学通报，1989，5(6)：373
11　陈超，方达超.巴马汀对离体乳头肌电生理特性的影响.中国药理学通报，1991，7(2)：138
12　刘美丽，冯汉林.高效薄层扫描法测定大叶刺黄柏各部生物碱的含量.中草药，1991，22(7)：308
13　陈碧珠，何丽一，李宝明等.十大功劳属药用植物中化学成分的含量测定(一).中国化学会第二届色谱学术会议论文集(上册).沈阳，1988年8月：C-11-1
14　陈燮芳，黄新生.反相高效液相色谱法测定十大功劳叶中小檗碱的含量.中成药，1997，19(12)：36
15　吕光华，陈建民，肖培根.改变检测波长HPLC法测定小檗属植物中的生物碱.药学学报，1995，30(4)：280

收稿日期:1998-08-17