HPLC法同时测定复方雌二醇控释贴片中雌／孕激素的含量

Determination of Compound Estradiol Controlled
Delivery Patches by HPLC

Wang Qiao,Ye Jincui and Chen Guoshen
(Institute of Materia Medica,Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou　310013)

AbstractObjective：To develop a HPLC method for assaying estradiol(E₂)and norethindrone acetate(NETA)in compound estradiol controlled delivery patches simultaneously.
Method:With Shim-pack CLC C₁₈(5μm)column(6.0mm×150mm),methanol and water(75∶25)as mobile phase,detector set at 280nm(0→8.50min),240 nm(8.51→15min).
Results:Linear ranges of E₂ and NETA were 2.0～20mg^.L^-1 and 6.0～60mg^.L^-1，respectively.The average recovery rates(n=5)of E₂ and NETA were 101.0%(RSD=1.6%)and 99.7%(RSD=1.4%),respectively.
Conclusion:This method provides a simple,rapid and accurate way to control the quality of compound estradiol controlled delivery patches.
Key words　HPLC,estradiol,norethindrone acetate,compound estradiol controlled delivery patches

　　含有雌二醇(E₂)和炔诺酮醋酸酯(NETA)的复方雌二醇控释贴片临床上用于治疗妇女更年期综合征^［1，2］。该制剂避免了单纯雌二醇贴片的治疗周期中仍需口服孕激素的不便。关于其质量分析，E₂有HPLC法^［3］，NETA的最大紫外吸收波长也有记载^［4］，但同时测定E₂和NETA二组分的含量，未见报道。我们建立了能同时测定2个不同吸收波长药物的RP-HPLC法。结果表明，本法简便迅速，结果准确。

1　仪器与试药
1.1　仪器　
岛津LC-10A高效液相色谱仪，SCL-10A系统控制器，SPD-10A紫外检测器，CTO-10A恒温箱，C-R6A数据处理机。
1.2　样品与试剂　
对照品雌二醇(99.5%)，上海华联制药厂，炔诺酮醋酸酯(99.7%)，浙江仙居制药股份有限公司；复方雌二醇贴片(20cm²每片，含E₂ 10mg,NETA 30mg)及空白贴片(不含主药，仅含辅料，20cm²每片)，自制；甲醇(HPLC级)；重蒸馏水。

2　色谱条件与色谱参数
2.1　色谱条件　
色谱柱：岛津Shim-pack CLC-ODS(5μm,6.0mm×150mm)；流动相：甲醇-水(75∶25)；流速：1.0mL^.min^-1；检测波长：280nm(0→8.5min)，240nm(8.51→15min)；柱温∶37℃；进样量：20μL；灵敏度：0.1AUFS。
2.2　色谱参数　
在本实验条件下，各组分色谱分离参数见表1，色谱图见图1。

表1　色谱参数

组分名称

保留时间/min

柱塔板数

拖尾因子

分离度

E₂

6.65

3993

1.00

2.94

NETA

10.33

6256

1.06

图1　样品HPLC图谱
1.E₂　　2.NETA

3　方法与结果
3.1　线性关系　
精密称取E₂对照品20mg，NETA对照品60mg，置100mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含E₂、NETA分别为200和600mg^.L^-1的对照品贮备液。精密取上述溶液1、3、5、7、10mL于100mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液。照上述色谱条件进样20μL。以E₂、NETA的浓度(mg^.L^-1)为横坐标，与其相对应的峰面积为纵坐标，求出E₂和NETA的线性回归方程分别为：

Y=9.17×10²X+3.27×10²　r=0.9997
Y=6.94×10³X+7.65×10³　r=0.9994

实验结果表明，E₂浓度在2.0～20mg^.L^-1，NETA在6.0～60mg^.L^-1范围内线性关系良好。
3.2　进样精密度试验　
在上述色谱条件下，取E₂、NETA浓度分别为10、30mg^.L^-1的对照品溶液重复进样，测定峰面积，E₂、NETA的RSD分别为1.5%、1.6%(n=6)。
3.3　重现性试验　
按样品的测定方法测定同一批样品，结果E₂、NETA含量平均值分别为标示量的93.7%、99.0%，RSD分别为1.7%、1.5%(n=6)。
3.4　稳定性试验　
精密吸取同一样品溶液20μL，日内每隔1 h进样测定，E₂、NETA的RSD均为1.6%(n=5)；连续测定3d，E₂、NETA的RSD分别为1.9%、1.8%(n=3)。
3.5　回收率试验　
取已知含量的本品1片，揭去防粘层，置100mL量瓶中，精密加入E₂、NETA对照品贮备液1mL，按样品测定项下操作。结果E₂、NETA的平均回收率分别为101.0%、99.7%，RSD分别为1.6%、1.4%(n=5)。
3.6　空白试验　
取空白贴片，按样品测定项下操作，结果在对照品的出峰时间不出现色谱峰，表明辅料对主药测定无干扰。
3.7　样品测定　
取本品1片，揭去防粘层，置100mL量瓶中，加乙酸乙酯10mL，浸泡过夜，超声10min，加甲醇至刻度，摇匀，放置，精密吸取1mL置10mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样测定，以外标法计算含量。结果见表2。

表2　3批样品含量测定结果(n=5)

样品批号

E₂

NETA

含量/%

RSD/%

含量/%

RSD/%

971118

103.3

1.4

96.3

1.5

971119

93.4

1.5

98.8

1.5

971120

104.4

1.6

106.1

1.4

4　讨论
　　本实验因系统控制器自动变换波长，利用E₂与NETA出峰时间不同(甲醇-水为75∶25时，E₂出峰时间约为6.6min，NETA为10.3min，在0→8.5min为280nm，8.51→15min时为240nm)，使E₂和NETA同时检测出，完成1次分析时间只需15min，具有快速准确的优点。
复方雌二醇控释贴片因有控释膜，需加乙酸乙酯后浸泡并超声，使控释膜完全剥落，溶解出控释膜覆盖下聚合物骨架中的药物，从而使含量测定准确。

作者单位：浙江省医学科学院药物研究所 杭州310013

参考文献
1　Whitehead MI,Fraser D,Schenkel L,et al.Transdermal administration of oestrogen/progestagen hormone replacement therapy.The Lancet,1990,335:310
2　Ross AH,Boyd ME,Colgan TJ,et al.Comparison of transdermal and oral sequential gestagen in combination with transdermal estradiol:effects on bleeding patterns and endometrial histology.Obstetrics & Gynecology,1993,82:773
3　周蓉蓉，朱永明，刘良初.皮肤渗透液中雌二醇含量的高效液相色谱法测定.药物分析杂志，1990，10(1)：41
4　USP.ⅩⅩⅢ.1995.1101

收稿日期:1998-06-09