HPLC用于重组L-天门冬酰胺酶Ⅱ的纯度分析与肽图谱测定

摘要目的：为了对重组L-天门冬酰胺酶Ⅱ进行肽图谱测定，以比较不同来源产品间一级结构的一致性。
方法：运用梯度洗脱/反相高效液相色谱法对样品进行纯度检查和肽图谱测定，并提出了简单的三氯乙酸变性方法，以解除蛋白质抗胰蛋白酶水解的能力。
结果：建立了重组L-天门冬酰胺酶Ⅱ的三氯乙酸变性/胰蛋白酶水解测定肽图谱的HPLC方法，肽图谱的比较反映出不同样品间的一级结构间存在差异。
结论：建立的肽图谱测定方法，过程简便，便于常规测定，样品间的结构差异值得进一步研究。
关键词　L-天门冬酰胺酶Ⅱ　高效液相色谱法　三氯乙酸变性　肽图谱

Purity Check and Tryptic Peptide Mapping of Recombinant
L-Asparaginase Ⅱ by HPLC

Han Jun,Sheng Longsheng,Xiang Bingren and An Dengkui
(Analytical Center,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)
Yang Zhongyuan
(Guangzhou Institute for Drug Control,Guangzhou 510160)

AbstractObjective：To check the purity and characterize the peptide map of recombinant L-asparaginase Ⅱ expressed in Escherichia coli,so as to validate the primary structural identity of several samples from various sources.
Method:Gradient elution/RP-HPLC was used.Prior to tryptic digest,a denaturing process with trichloroacetic acid was carried out to eliminate the protease-resistance from the protein.
Results:Structural difference among several samples has been shown according to the peptide maps thus obtained.
Conclusion:The method described was simple and easy-to-use.It is necessary to perform further research to exploit the primary strucutral difference of the protein.
Key words　L-asparaginase Ⅱ,HPLC,denaturation with trichloroacetic acid,peptide map

　　大肠杆菌产生2种天然的左旋天门冬酰胺同功酶，即L-天门冬酰胺酶Ⅰ和Ⅱ。L-天门冬酰胺酶Ⅰ由胞质连续产生，与L-天门冬酰胺有较低的亲和力，无抗肿瘤活性；L-天门冬酰胺酶Ⅱ(E.C.3.5.1.1)由周质分泌和正调控表达，是一种高亲和力酶，临床上与其它药物合用，治疗淋巴母细胞瘤和恶性白血病。L-天门冬酰胺酶Ⅱ在60、70年代国外已有产品上市，我国在70年代曾生产过。编码L-天门冬酰胺酶Ⅱ的基因碱基顺序和相应的氨基酸顺序在80年代末得到了阐明^［1，2］。一级结构及晶体学的研究结果表明，L-天门冬酰胺酶Ⅱ分子由4个相同亚基组成，每个亚基含326个氨基酸，由此计算的理论分子量为34594.2Da。随着生物技术的发展，目前普遍通过基因重组技术生产L-天门冬酰胺酶Ⅱ，以满足临床治疗的需要，国内亦正对此进行研究。分子量、肽图谱和氨基酸顺序的测定是蛋白质研究的重要环节，也是基因重组产品质量控制的重要组成部分。为确证重组L-天门冬酰胺酶Ⅱ的一级结构并对产品进行质量控制，本文采用反相高效液相色谱法对国内外重组L-天门冬酰胺酶Ⅱ和对照品进行比较，对其鉴定和纯度分析，并对肽图谱的测定方法进行了初步研究。实验结果显示，部分来源的重组L-天门冬酰胺酶Ⅱ与对照品之间存在结构上的差异，这种差异亦反映在它们的分子量的测定结果中。

1　仪器与材料
高效液相色谱仪：LC-10AT双泵，CTO-10A柱温箱，SPD-M10A光电二极管阵列检测器，检测波长210nm，CLASS-10A色谱数据处理工作站。
实验用L-天门冬酰胺酶Ⅱ：样品a为中科院上海生化所提供的对照品；样品b和c分别为美国MSD药厂和日本协和发酵株式会社的进口药物；样品d系国内某单位研制的基因工程产品。
TPCK处理过的牛胰蛋白酶(Sigma公司)，三氟乙酸(德国E.Merck公司)，光谱纯乙腈(英国BDH公司)，重蒸水。其余试剂均为分析纯，使用前未经进一步处理。

2　试液配制
流动相A：取三氟乙酸1mL于1000mL经0.45μm滤膜抽滤脱气的水中；流动相B：取三氟乙酸0.85mL于经0.50μm滤膜抽滤脱气的800mL乙腈和200mL水的混合溶剂中。
碳酸氢铵溶液：取碳酸氢铵1.98g溶于250mL水中，稀氨水调pH至8.5；胰蛋白酶溶液：取TPCK处理过的牛胰蛋白酶用水配成1mg^.mL^-1的溶液，-20℃内冷冻保存，1周内使用。10%三氯乙酸溶液：三氯乙酸10g溶于100mL水。

3　鉴定和纯度分析
色谱柱：VydacC₁₈(218TP54)，5μm,4.6mm×250mm，孔径30nm；预柱：Hypersil ODS,5μm，4.6mm×75mm。柱温：60℃，流速：1.40mL^.min^-1。二元梯度洗脱程序：0～60min内，流动相B的浓度20%～60%。每次梯度结束后，色谱柱用流动相B清洗20min，再用流动相A平衡。检测波长：210 nm。
用0.1%三氟乙酸溶液配制L-天冬酰胺酶Ⅱ的1mg^.mL^-1溶液，取20μL进样测定。
L-天门冬酰胺酶Ⅱ在流动相的酸性和有机改性剂环境中，发生变性，亚基之间的非共价结合形式被破坏，色谱图中蛋白质显示为亚基的单峰形式。图1为样品a～d在上述色谱条件下获得的色谱图，可以看出，主峰附近均含有微量的杂质峰，主峰纯度按峰面积归一化法计算均大于98%，符合肽图谱分析对样品纯度的要求。

图1　L-天门冬酰胺酶Ⅱ样品色谱图

　　样品a～d具有相同的色谱保留时间，显示了同等的疏水性质。

4　肽图谱测定与分析
4.1　色谱条件　
色谱柱：SephasilC₁₈，5μm，4.6mm×250mm，Pharmacia生物技术公司提供。预柱：Hypersil ODS,5μm，4.6mm×75mm。柱温：50℃，流速：1.20mL^.min^-1。二元梯度洗脱程序：流动相B的浓度0～100min，0～20%；100～150min,20%～28%;150～180min,28%～46%。每次梯度结束后，色谱柱用流动相B清洗20min，并用流动相A平衡。检测波长：210nm。
4.2　酶解与肽图谱测定　
实验发现，L-天门冬酰胺酶Ⅱ有抗胰蛋白酶水解的性质。这是由于L-天门冬酰胺酶Ⅱ分子存在一定的三维空间结构，阻止了胰蛋白酶与氨基酸残基中碱性位点的作用。经筛选，本文提出用10%三氯乙酸处理L-天门冬酰胺酶Ⅱ，使之变性，来解除其抗胰蛋白酶水解的能力。
其变性与酶解的步骤如下：分别取L-天门冬酰胺酶Ⅱ各样品1mg或相当的冻干粉置聚丙烯小管，加水0.1mL使样品完全湿润并溶解，续加三氯乙酸溶液1mL，密塞，轻轻振摇，放置2h，并不时振摇，使L-天门冬酰胺酶Ⅱ充分变性、析出，3500r^.min^-1离心10min，倾去上层液，残留物用水少量多次洗涤至近中性，加碳酸氢铵溶液1mL振摇使溶，加胰蛋白酶溶液10μL，37℃保温3h，取出，补加胰蛋白酶溶液10μL，继续水解12h，取出，加三氟乙酸10μL终止反应。取上述各酶解后的溶液200μL，进样测定肽图谱，得到的各样品的肽图谱如图2。另取不含L-天门冬酰胺酶Ⅱ的冻干粉成分作空白样品，同法处理，测定。结果表明，样品中的冻干粉成分对肽图谱的测定没有影响。
4.3　肽图谱分析　
胰蛋白酶专一裂解Arg和Lys羧基端的肽键。L-天门冬酰胺酶Ⅱ的亚基中含7个Arg和24个Lys，理论上有31个裂解位点，分子内1对双硫键的存在，未经还原/羧甲基化的样品应产生31个肽段。由于酶解反应常难以完全进行(如肽链中Arg或Lys与Pro直接相连情况下)，以及胰蛋白酶中残留的胰凝乳蛋白酶等产生的专属位点裂解，实际测得的肽段数高于理论值。由图2可知，样品b和c的图谱与样品a的图谱一致，显示三者在此技术范围内结构上具有同一性。样品d的图谱与样品a的图谱相比，a中箭头所示峰为d中箭头所示峰替代，表明肽链中存在氨基酸的变异，亲水性更强的氨基酸取代了原有氨基酸。作者运用电喷雾离子化质谱法对上述4个样品的分子量进行了测定，结果显示样品a～c的分子量相同，测得的分子量均为(34591±1)Da，与理论计算值相符，而样品d的分子量为(34541±1)Da。样品d中氨基酸发生变异的位置目前正在作进一步的研究，已取得初步结果，将另文发表。

图2　L-天门冬酰胺酶Ⅱ样品HPLC肽图谱

5　讨论
5.1　影响酶解反应的因素主要包括介质的pH、温度、酶与底物的比例和合适的反应时间。蛋白酶水解蛋白质的最适pH为8～9。本文探讨了37℃和pH8.5下，酶与底物的比例、酶解反应时间对水解的影响。根据实验结果，并经进一步的优选，最终确定了上述酶解方法。
5.2　在确定的酶解条件下，考察了肽图谱测定的重现性。同一样品酶解后进样测定3次，得到的肽图谱各峰峰数均保持一致，且不同次进样时各峰的保留时间均在±15s内波动；同一样品取3份分别按确定的酶解条件水解并测定，肽图谱亦很好重现。
5.3　L-天门冬酰胺酶Ⅱ肽链的第99位和第127位有2个Cys，形成1对分子内双硫键。对于含双硫键的蛋白质进行肽图谱测定和一级结构分析时，往往需要拆开双硫键，再进行酶解。为便于比较，实验过程中我们曾参考文献［3］的方法，对反应温度和时间作适当改进，将L-天门冬酰胺酶Ⅱ进行还原/羧甲基化反应，产物经HPLC脱盐，真空干燥除酸。采用纯度分析的色谱条件对还原/羧甲基化后的样品进行纯度分析，发现还原/羧甲基化反应不完全，且反应的转化率不重现，数次反应产率最高只有92%左右，可能与还原/羧甲基化使用的试剂纯度等因素有关。因而，还原/羧甲基化的样品经酶解测得的肽图谱重现性差。
5.4　试剂和水的纯度对空白梯度的信号影响较大。将流动相B中三氟乙酸浓度设为流动相A中三氟乙酸浓度的85%，克服了随着流动相B浓度增加，色谱基线逐渐向上漂移的现象。实验使用的水中含有的微量杂质，在梯度洗脱过程中，当流动相B的浓度达到38%左右时，色谱图中出现一系列杂质峰，影响肽图谱的检测。在流动相A泵后、进样阀前连接一色谱预柱，可消除系列杂质峰的影响。

6　结语
肽图谱是蛋白质一级结构研究中极为有用的技术，它不但可以比较重组与天然蛋白质结构之间的同一性，确认基因工程上游和下游处理过程中是否发生差错、重组产物中是否存在后转译化学修饰及未预期氨基酸的变异等，而且不同批次产品的肽图谱的比较可验证工艺过程的稳定性。本文将L-天门冬酰胺酶Ⅱ用三氯乙酸变性处理后酶解测定，肽图谱重现性好，肽图谱的比较反映了重组产品与对照品的结构之间存在差异。变性操作简便快速，可避免还原/羧甲基化反应过程中因反应不完全而使肽图谱测定的重现性和稳定性差的缺点，适于产品的常规质量控制。

作者单位：韩俊　盛龙生　相秉仁　安登魁 中国药科大学分析中心 南京210009
杨仲元 广州市药品检验所 510160

参考文献
1　Jennings M P,Beacham I R.Analysis of the Escherichia coli gene encoding L-asparaginase Ⅱ,ansB,and its regulation by cyclic AMP receptor and FNR proteins.J Bacteriology,1990,172(3):1491
2　Bonthron D T.L-asparaginase of Escherichia coli K-12:cloning,mapping,sequencing of the ansB gene.Gene,1989,78:37
3　Pan Y-C E,Widema J,Blacher R,et al.Use f high performance liquid chromatography for preparing samples for microsequencing.J Chromatogr,1984,297:13

收稿日期:1998-04-20